Cystine Transport en Cystinosine
Cystine stapelt zich op binnen de lysosomen van cystinotische leukocyten14 en fibroblasten.44 Chloroquine en andere remmers van de lysosomale eiwitafbraak verminderen de heraccumulatie van cystine in uitgeputte cystinotische cellen, wat erop wijst dat intracellulaire eiwitafbraak de bron is van de overmaat aan cystine.45 Het cystinegehalte van normale en cystinotische cellen kan ook worden verhoogd door ze te laden met cystine dimethyl ester46 of cysteïne-glutathion gemengd disulfide44 ; met name echter de uitscheiding van cystine uit lysosomen is duidelijk verminderd in cystine-geladen cystinotische cellen.44,46 Cystine efflux van cellen afkomstig van heterozygote dragers van het nefropathische cystinose gen is niet significant verstoord in vergelijking met wild-type cellen.44 Meting van cystine-cystine countertransport in lysosomale granules toont echter duidelijk een afwezigheid aan in homozygote patiënten, met waarden voor heterozygote dragers die ongeveer de helft zijn van die van normale controle cellen47; defect lysosomaal cystine transport is dus het oorzakelijke defect in cystinose.
De biochemische diagnose van zowel patiënten48 als heterozygote dragers49 was van cruciaal belang voor de fijne kartering van het cystinose gen op chromosoom 17p13. Een belangrijke doorbraak was de detectie van genomische deleties voor een gekoppelde microsatellietmarker, gevolgd door de identificatie van het CTNS-gen binnen het minimale deletie-interval.50 Het CTNS-gen bestaat uit 12 exonen en codeert voor een 367-aminozuur eiwit dat cystinosine wordt genoemd. Cystinosine bestaat uit zeven transmembraan domeinen, een 128-aminozuur N terminus die zeven glycosylatie sites bevat, en een 10-aminozuur cytosolisch C terminus. Alle patiënten met de verschillende subtypes van cystinose blijken een mutatie in het CTNS-gen te hebben (d.w.z. dat er tot dusver geen aanwijzingen zijn voor genetische heterogeniteit). De meest voorkomende mutatie is een 57-kb deletie die de 5′-regio stroomopwaarts van exon 1051,52 verplaatst; meer dan 70% van de patiënten met nefropathische cystinose van Noord-Europese afkomst zijn homozygoot voor deze mutatie.52-Bendavid en collega’s hebben fluorescentie in situ hybridisatieprobes voor deze grote deletie ontwikkeld, de eerste in zijn soort voor een lysosomale opslagstoornis.55 Afzonderlijke mutaties met een vermoedelijk founder effect zijn geïdentificeerd in Frans Canada56 (W138X, van Ierse afkomst) en in de provincie Bretagne in Frankrijk57 (een splice-site mutatie aan het eind van exon 8). Eén recurrente missense mutatie (G339R) is geïdentificeerd in twee specifieke etnische populaties: twee niet-verwante families van Amish-Mennonitische afkomst en vijf niet-verwante families van Joods-Marokkaanse afkomst.58-61 Er zijn ook nog eens 50 mutaties van CTNS geïdentificeerd, waaronder ten minste drie patiënten met mutaties in de promotorregio van het gen.62 Patiënten met juveniele of oculaire cystinose zijn homozygoot voor een “mildere” mutatie, meestal een puntmutatie zonder verstoring van het open leesraam; als alternatief zijn deze patiënten samengestelde heterozygoten voor een milde mutatie en een ernstigere mutatie.17,59
Cystinosine komt op grote schaal tot expressie, met een bijzonder overvloedig transcript in pancreas, spieren en nieren.50 Immunohistochemie met anticystinosine-antilichamen63 en transfectie van cellen met epitoop-getagd complementair DNA (cDNA)64,65 onthult dat het eiwit tot expressie komt in lysosomen. Zoals verwacht is de expressie van cystinosine bijzonder sterk in de proximale tubulus van de nier.63 De lokalisatie van cystinosine op het lysosomale membraan is afhankelijk van zowel een op tyrosine gebaseerd GYDQL lysosomaal sorteermotief op de C-terminale staart als van een YFPQA pentapeptide binnen de vijfde inter-transmembraan lus. Het YFPQA motief is enigszins uniek in die zin dat het een zeldzaam voorbeeld is van een lysosomaal sorteersignaal dat zich buiten de cytoplasmastaart bevindt.64 Het lijkt een zekere capaciteit te bezitten om de sortering van cystinosine op zichzelf te redden, aangezien een cystinosinemutant met een afwezig GYDQL motief maar een intact YFPQA motief nog gedeeltelijk naar lysosomen lokaliseert.65 Een minderheid van de cystinosemutaties beïnvloedt de lysosomale doelwitbepaling van cystinosine, door een primaire verstoring van het GYDQL motief of door nog niet gekarakteriseerde effecten op de secundaire structuur.66
Functionele karakterisering van cystinosine maakte gebruik van de omleiding van het eiwit naar het plasmamembraan in een mutant, cystinosine-.GYDQL, die het C-terminale GYDQL motief mist.67 Cystinosine-.GYDQL functioneert dus als een H+-gestuurde cystine transporter aan het plasmamembraan van getransfecteerde cellen. Het is zeer specifiek voor L-cystine; andere aminozuren, in het bijzonder het monosulfide cysteïne, zijn geen substraten. Cystinosine is saturabel en volgt Michaelis-Menton kinetiek, met een Km voor cystine van ∼280 μM.67 Inwaarts transport wordt aanzienlijk gestimuleerd door een zuur-buiten extracellulaire pH (Fig. 14-6); ineenstorting van deze transmembraan H+ gradiënt door de toevoeging van nigericine heft het transport op, consistent met H+-cystine cotransport door cystinosine. Lysosomaal cystine transport is op zijn beurt afhankelijk van de aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP), dat het lysosomale H+-ATPase voedt en cystine efflux (Fig. 14-7) aanstuurt.46,68,69
Het cystinosine-.GYDQL construct is gebruikt voor functionele karakterisering van ziekte-geassocieerde missense mutaties in cystinosine. Voor het grootste deel correleren transport en klinische fenotypes, met afschaffing van transport door mutaties geassocieerd met nefropathische cystinose en residuele functie gemedieerd door constructen die mutaties tot expressie brengen geassocieerd met juveniele en oculaire subtypes van de ziekte.66 Sommige mutaties die geassocieerd worden met juveniele cystinose schaffen echter het transport af in de context van cystinosine-.GYDQL, wat suggereert dat deze mutaties minder effect hebben op het cystinosine van de volle lengte dat tot expressie komt in lysosomale membranen; een mogelijkheid is dat cystinosine een interactie aangaat met lysosomale eiwitten die deze specifieke mutantvormen stabiliseren.66 Het omgekeerde komt ook voor, zodat sommige nefropathische cystinosemutaties een minimaal effect hebben op het transport dat gemedieerd wordt door cystinosine-.GYDQL.66
Gerichte deletie van cystinosine in muizen leidt tot cystine-accumulatie in meerdere organen, waaronder de nier.70 Plaatselijke afzetting van cystinekristallen kan worden waargenomen in verschillende weefsels, waaronder in proximale tubulus-cellen. Deze muizen vertonen echter geen proximale tubulopathie, wat suggereert dat de ophoping van cystinekristallen op zich niet de oorzaak is van de ziekte.70 De oogafwijkingen bij muizen met cystinosine-deficiëntie lijken echter sterk op die bij patiënten met cystinose. Zo ontwikkelen deze dieren corneale cystinekristalafzettingen en gedepigmenteerde vlekken in hun netvlies, wat wijst op een retinopathie.70