Elisabeth trouwde in 1559 met Filips II van Spanje, zoon van Karel V, de Heilige Roomse keizer, en Isabella van Portugal. Oorspronkelijk was zij bij volmacht getrouwd in de Notre Dame (met de hertog van Alba in de plaats van Philips) voordat zij Frankrijk verliet, maar de eigenlijke ceremonie vond plaats in Guadalajara, Spanje, bij haar aankomst. Het huwelijk was een gevolg van de Vrede van Cateau Cambrésis (1559). Zijn tweede vrouw, Maria I van Engeland, was kort daarvoor overleden, waardoor Elisabeth van Valois Filips’ derde vrouw werd.
Tijdens haar huwelijk ontmoette zij de schilder Sofonisba Anguissola, en Ana de Mendoza, die de rest van haar leven bij haar zou blijven wonen. Filips II benoemde Anguissola tot hofdame en hofschilderes van zijn koningin. Onder de hoede van Anguissola verbeterde Elisabeth haar amateurschilderkunst. Anguissola beïnvloedde ook het artistieke werk van haar kinderen, Isabella Clara Eugenia en Caterina Michaela, gedurende haar tijd aan het hof.
Philips was volledig betoverd door zijn 14-jarige bruid, en had in 1564 zijn ontrouw opgegeven. Ondanks het grote leeftijdsverschil was Elisabeth ook heel tevreden met haar echtgenoot (in brieven aan haar moeder verklaarde zij zich gelukkig met zo’n charmante prins getrouwd te zijn). Filips organiseerde graag riddertoernooien om zijn vrouw te vermaken. Elisabeth was de hofdame van de drie jonge prinsen van het Spaanse hof: Carlos, Prins van Asturië, Jan van Oostenrijk (buitenechtelijke zoon van Karel V), en Alexander Farnese, Hertog van Parma (zoon van Karel V’s buitenechtelijke dochter Margaretha).
Elisabeth was oorspronkelijk verloofd met Philips zoon, Carlos, Prins van Asturië, maar politieke verwikkelingen dwongen haar onverwachts tot een huwelijk met Filips. Haar relatie met haar verwarde stiefzoon Carlos was warm en vriendschappelijk. Ondanks berichten over zijn steeds bizarre gedrag, was Carlos altijd vriendelijk en zacht voor Elisabeth. Toen Filips hem uiteindelijk moest opsluiten (wat kort daarop tot de dood van de prins leidde), huilde Elisabeth dagenlang.
Philips was zeer gehecht aan Elisabeth en bleef haar zelfs terzijde staan toen zij ziek was van de pokken. Elisabeths eerste zwangerschap in 1560 resulteerde in een doodgeboren zoon, in 1564 gevolgd door een miskraam van een tweeling. Later beviel zij op 12 augustus 1566 van de Spaanse Infante Isabella Clara Eugenia, en op 10 oktober 1567 van Isabella’s jongere zuster Catherine Michelle van Spanje. Phillip en Elisabeth hadden een hechte band met hun beide dochters en kochten jam, poppen, speelgoed en nog veel meer voor hen. Er wordt gezegd dat ‘beiden zich verheugden over de geboorte van Isabella alsof het de geboorte van een zoon was geweest’. Elisabeth kreeg nog een miskraam op 3 oktober 1568, en stierf nog dezelfde dag, samen met haar pasgeboren dochtertje.
Na de dood van Elisabeth bood Catharina de’ Medici haar jongere dochter Margaretha aan als bruid voor Filips. Philips sloeg het aanbod af.