FLAG-tag

FLAG-tag, of FLAG-octapeptide, of FLAG-epitoop, is een polypeptide-eiwitmarkering die met recombinant-DNA-technologie aan een eiwit kan worden toegevoegd en het sequentiemotief DYKDDDDK heeft (waarbij D=asparaginezuur, Y=tyrosine, en K=lysine). Het is een van de meest specifieke tags en het is een kunstmatig antigeen waarvoor specifieke monoklonale antilichamen met een hoge affiniteit zijn ontwikkeld, die derhalve kunnen worden gebruikt voor de zuivering van eiwitten door middel van affiniteitschromatografie en ook kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van eiwitten in levende cellen. Het is gebruikt om recombinant, overgeëxpresseerd eiwit te scheiden van wild-type eiwit dat door het gastheerorganisme tot expressie wordt gebracht. Het kan ook worden gebruikt voor de isolatie van eiwitcomplexen met meerdere subeenheden, omdat de milde zuiveringsprocedure de neiging heeft dergelijke complexen niet te verstoren. Het is gebruikt om eiwitten te verkrijgen van voldoende zuiverheid en kwaliteit om 3D-structuurbepaling door middel van röntgenkristallografie uit te voeren.

Een FLAG-tag kan worden gebruikt in veel verschillende tests die herkenning door een antilichaam vereisen. Als er geen antilichaam tegen een bepaald eiwit bestaat, kan door toevoeging van een FLAG-tag aan een eiwit dit eiwit worden bestudeerd met een antilichaam tegen de FLAG-sequentie. Voorbeelden zijn cellulaire lokalisatiestudies door immunofluorescentie, immunoprecipitatie of detectie door SDS PAGE-eiwitelektroforese en Western blotting.

De peptidesequentie van de FLAG-tag vanaf de N-terminus tot de C-terminus is: DYKDDDDK (1012 Da). Bovendien kan het in tandem worden gebruikt, gewoonlijk het 3xFLAG-peptide: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (waarbij de laatste tag codeert voor een enterokinase-splitsingsplaats). Het kan worden gefuseerd met de C-terminus of de N-terminus van een eiwit, of worden ingevoegd in een eiwit. Sommige in de handel verkrijgbare antilichamen (b.v. M1/4E11) herkennen de epitoop alleen wanneer deze zich aan de N-terminus bevindt. Andere beschikbare antilichamen (bv. M2) zijn echter positie-ongevoelig. Het tyrosineresidu in de FLAG-tag kan gesulfateerd zijn, wat de antilichaamherkenning van de FLAG-epitoop kan beïnvloeden. De FLAG-tag kan worden gebruikt in combinatie met andere affiniteitstags, bijvoorbeeld een polyhistidine-tag (His-tag), HA-tag of myc-tag.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.