Gefossiliseerde huid onthult co-evolutie met veren en metabolisme bij gevederde dinosauriërs en vroege vogels

Fossiele zacht weefsel structuur

Kleine stukjes weefsel (0.01-0.4 mm2; Fig. 1a-d en supplementaire Fig. 2-6) zijn nauw geassocieerd met fossiele veren (d.w.z.., meestal binnen 500 µm van koolstofhoudende veerresten, supplementaire Fig. 2e, g, j, k, o, s, t). De vlekken zijn definitief van fossiel weefsel, en zijn niet het gevolg van contaminatie van het oppervlak met modern materiaal tijdens het prepareren van de monsters, aangezien ze bewaard zijn gebleven in calciumfosfaat (zie ‘Taphonomie’, hieronder); verder vertonen verscheidene monsters randen die gedeeltelijk overlapt worden door de omringende matrix. De weefsels zijn dus niet gewoon aan het oppervlak van het monster blijven kleven als gevolg van contaminatie door zwevende deeltjes in het laboratorium.

De weefselflarden zijn typisch 3-6 µm dik en planair (Fig. 1a-e). Dwarsdoorsneden en gebroken oppervlakken tonen een binnenste vezelige laag (1,0-1,2 µm dik) tussen twee dunnere structuurloze lagen (0,2-0,5 µm dik) (Fig. 1f-h). Het buitenoppervlak van de structuurloze laag is glad en kan een subtiele polygonale textuur vertonen, gedefinieerd door polygonen van 10-15 µm breed (Fig. 1e, h).

De vezelige laag vertoont ook polygonen (Figs. 1f, h en 2a-e, en Supplementary Fig. 6) die arrays van dicht opeengepakte vezels bevatten van 0.1-0.5 µm breed (Fig. 2f-i en Supplementary Fig. 5f). Goed bewaarde vezels vertonen helicoïdale verdraaiingen (Fig. 2h, i). De vezels in de marginale delen van elke polygoon zijn 0,1-0,3 µm breed en evenwijdig met het weefseloppervlak georiënteerd; die in het binnenste van elke polygoon zijn 0,3-0,5 µm breed en staan meestal loodrecht op het weefseloppervlak (Fig. 2b, h en Supplementary Fig. S6d). In de rand 1-2 µm van elke polygoon staan de vezels meestal loodrecht op de laterale polygoonrand en eindigen ze bij, of overbruggen ze de verbinding tussen, aangrenzende polygonen (Fig. 2f, g en Supplementary Fig. 6e). De polygonen zijn meestal even groot, maar zijn plaatselijk langgerekt en onderling uitgelijnd, waarbij de dikke vezels in elke polygoon subparallel aan het weefseloppervlak liggen en de dunne vezels, parallel aan de polygoonrand (Fig. 2j, k en Supplementary Fig. 6g-l). Sommige polygonen vertonen een centrale depressie (Fig. 2c-e en Supplementary Fig. 6a-c) waarin de dikke vezels een bolvormige structuur van 1-2 µm breed kunnen omhullen (Fig. 2e).

Fossiele corneocyten

De textuur van deze fossiele weefsels verschilt van die van schelpen van conchostraca en visschubben uit het gastsediment, de schelp van de moderne Mytilus, moderne en fossiele veerrachis en moderne epidermis van reptielen (supplementaire Fig. 7a-n). De langgerekte geometrie van sommige polygonen (Fig. 2j, k en Supplementary Fig. 6g, l) impliceert elastische vervorming van een niet-biomineraliseerd weefsel als gevolg van mechanische spanning. Op basis van hun grootte, geometrie en interne structuur, worden de polygonale structuren geïnterpreteerd als corneocyten (epidermale keratinocyten). Bij moderne amnioten zijn dit veelvlakkige afgeplatte cellen (1-3 µm × ca. 15 µm) gevuld met keratine tonofibrillen, lipiden en matrixproteïnen18,19,20 (Fig. 3a, b en supplementaire Figs 2u-x, 8, 9). De buitenste structuurloze laag van het fossiele materiaal komt overeen met de celrand; deze is dikker dan het oorspronkelijke biologische sjabloon, d.w.z. de hoorncelomhulling en/of het celmembraan, maar dit is niet onverwacht, als gevolg van diagenetische overgroeiing door calciumfosfaat (zie ‘Taphonomie’). De vezels in de fossiele corneocyten worden geïdentificeerd als gemineraliseerde tonofibrillen: rechte, niet vertakkende bundels supercoiled α-keratine fibrillen van 0,25-1 µm breed18,21 die de belangrijkste component vormen van het cytoskelet van de corneocyten22 en omhuld worden door amorfe cytoskeletale proteïnen22. De dunne tonofibrillen abuteren vaak die van de aangrenzende cel (Fig. 2g en supplementaire Fig. 6e), maar kunnen plaatselijk de grens tussen aangrenzende cellen overbruggen (Fig. 2f). Dit laatste doet denken aan desmosomen, gebieden van sterke intercellulaire aanhechting tussen moderne corneocyten23. De centrale bolvormige structuren binnen de fossiele corneocyten lijken op dode celkernen24, zoals in corneocyten van extante vogels (maar niet extante reptielen en zoogdieren)24 (supplementaire Fig. 8). De positie van deze pycnotische kernen wordt vaak aangegeven door depressies in het corneocytenoppervlak bij extante vogels24 (Fig. 3b); sommige fossiele cellen vertonen gelijkaardige depressies (Fig. 2c en supplementaire Fig. 6a-c).

Taphonomie

Keratine is een relatief recalcitrant biomolecuul vanwege zijn sterk vernette parakristallijne structuur en zijn hydrofobe, apolaire karakter23. Replicatie van de fossiele corneocyten in calciumfosfaat is dus enigszins onverwacht omdat dit proces gewoonlijk steile geochemische gradiënten vereist die kenmerkend zijn voor vroeg verval25 en gewoonlijk van toepassing is op weefsels die gevoelig zijn voor verval, zoals spierweefsels26 en spijsverteringsweefsels27. Recalcitrante weefsels zoals huidcollageen kunnen echter worden gerepliceerd in calciumfosfaat wanneer zij een inherente bron van calcium bevatten en, in het bijzonder, fosfaationen die vrijkomen tijdens het bederf28. Corneocyten bevatten bronnen van deze beide ionen. Tijdens de terminale differentiatie neemt de intracellulaire calciumconcentratie toe29 en worden de α-keratineketens uitgebreid gefosforyleerd23. Voorts zijn de lipidekorrels30 van corneocyten rijk aan fosfor en fosfaat31. Deze chemische verbindingen zouden vrijkomen bij de afbraak van de korrels en neerslaan op het resterende organische substraat, d.w.z. de tonofibrillen.

In levende zoogdieren vereisen dicht opeengepakte arrays van tonofibrillen een overvloedige interkeratine matrix proteïnen voor stabiliteit32. Deze eiwitten komen echter niet voor in de fossielen. Dit is niet onverwacht, aangezien de proteïnen zeldzaam zijn in levende aviaire corneocyten33 en, wat kritisch is, voorkomen als verspreide monomeren34 en een lager conserveringspotentieel zouden hebben dan de sterk vernette en gepolymeriseerde keratinebundels van de tonofibrillen. De buitenste structuurloze laag van de fossiele corneocyten is dikker dan het (de) waarschijnlijke biologische sjabloon(s), d.w.z. de hoorncelomhulling (een tot 100 nm dikke laag lipiden, keratine en andere eiwitten die het celmembraan vervangt tijdens de terminale differentiatie34) en/of het celmembraan. Dit kan het gevolg zijn van een lokaal micromilieu dat bevorderlijk is voor de neerslag van calciumfosfaat: tijdens de einddifferentiatie accumuleren korrels keratohyaline, een sterk gefosforyleerd eiwit35 met een hoge affiniteit voor calciumionen36 , zich aan de periferie van de zich ontwikkelende corneocyten37. De dikte van de buitenste vaste laag calciumfosfaat in de fossielen, plus de geleidelijke overgang van deze naar de binnenste vezelige laag, suggereert dat de neerslag van fosfaat van de randen naar het inwendige van de corneocyten is gegaan. In dit scenario zou de beschikbaarheid van fosfaat in de marginale zones van de cellen groter zijn geweest dan nodig voor de replicatie van de tonofibrillen. Het extra fosfaat zou zijn neergeslagen als calciumfosfaat in de interstitiële ruimten tussen de tonofibrillen, voortschrijdend naar binnen vanuit de binnenzijde van de celrand.

Huidvervelling bij gevederde dinosauriërs en vroege vogels

In uitheemse amniotes, is de epidermale verhoornde laag typisch 5-20 cellen dik (maar de dikte varieert per soort en locatie op het lichaam38). De fossiele hoorncellen zijn echter maar één cel dik (Fig. 1f en supplementaire Figs. 5c, 10). Dit, plus de consistent kleine omvang (<400 μm) van de patches en de opmerkelijk hoge getrouwheid van de conservering, is inconsistent met selectieve conservering van een ononderbroken vel in situ weefsel. In een minderheid (n = 8) van de voorbeelden komt de huid voor aan de rand van het monster van fossiele weke delen en zou dus mogelijk een kleiner fragment kunnen zijn van een oorspronkelijk groter stuk fossiele huid (met de rest van het stuk op de fossiele plaat). In de meeste voorbeelden ligt de volledige omtrek van het huidfragment echter binnen de rand van een monster. Onderzoek van de randen van verschillende monsters bij hoge vergroting laat zien dat het monster en het omringende sediment vaak in precies hetzelfde vlak liggen (b.v., supplementaire Fig. 10). Zelfs wanneer de rand van het huidmonster door sediment wordt bedekt, is het onwaarschijnlijk dat het monster veel groter is geweest dan de schijnbare grootte, omdat de fossiele huid, die bijna perfect vlak is, een natuurlijk splijtvlak vormt.

Er is geen bewijs dat de bewaarde dikte van de huid een artefact is van preparatie of erosie. Tijdens het splijten van een rotsplak gaat het splijtvlak vaak op een ongelijke manier door de zachte weefsels, waardoor structuren op verschillende diepten worden blootgelegd. Bij de hier bestudeerde fossielen gaat het splijtvlak gewoonlijk door de corneocyten (waardoor hun inwendige structuur wordt blootgelegd), en zelden langs de buitenkant van de corneocytenlaag. Er zijn geen aanwijzingen voor verwijdering van meer dan één laag corneocyten: FIB-secties tonen de preservatie van slechts één laag en verscheidene SEM-beelden tonen volledige verticale doorsneden door de gepreserveerde huid (waar de relatie met het boven- en onderliggende sediment zichtbaar is), met bewijs voor slechts één laag corneocyten. De vezelige binnenvulling van de fossiele corneocyten wordt blootgelegd waar het splijtvlak van de fossiele plak door de weefselflarden loopt. De topografie van de fossiele corneocyten varieert echter met de positie van het splijtvlak, dat plaatselijk door de zachte weefsels kan variëren op een schaal van millimeters: de corneocyten kunnen zich presenteren met verhoogde randen en een centrale depressie, of met depressieve randen en een centrale verhoogde zone (Fig. S9).

De grootte, onregelmatige geometrie en dikte van de patches van corneocyten lijken op afgeworpen schilfers van de verhoornde laag (roosachtige deeltjes39; Fig. 3). Bij levende vogels worden corneocyten individueel of in patches tot 0,5 mm2 afgeworpen die in veren kunnen worden ingesloten (Fig. 3c, d en Supplementary Fig. 2u, v). De hier beschreven fossielen leveren het eerste bewijs voor het vervellingsproces van huid bij basale vogels en niet-avische maniraptoraanse dinosauriërs en bevestigen dat tenminste sommige niet-avische dinosauriërs hun huid in kleine patches afwerpen40. Deze manier van vervellen is identiek aan die van moderne vogels18 (Fig. 3c, d) en zoogdieren20 en impliceert een continue somatische groei. Dit staat in contrast met veel overgebleven reptielen, b.v, lepidosaurussen, die hun huid in zijn geheel of in grote delen afwerpen21, maar de vervellingsstijl kan worden beïnvloed door factoren zoals dieet en omgeving41.

Evolutionaire implicaties van de fossiele corneocytenstructuur

De fossiele corneocyten vertonen belangrijke aanpassingen die worden aangetroffen in hun tegenhangers bij bestaande vogels en zoogdieren, met name hun afgeplatte veelhoekige geometrie en vezelige celinhoud die consistent is met α-keratine tonofibrillen16. Verder vertonen de fossiele tonofibrillen (net als in extraverte voorbeelden22) robuuste intercellulaire verbindingen en vormen ze een continue steiger over het hoornvlies (Fig. 2b, c, j en Supplementary Fig. 6). In tegenstelling daarmee bevatten corneocyten bij extraverte reptielen een homogene massa van β-keratine (met bijkomende proteïnen aanwezig in het celomhulsel) en versmelten ze tijdens de ontwikkeling, waarbij ze rijpe β-lagen vormen zonder duidelijke celgrenzen42. Het behoud van pycnotische kernen in de fossiele corneocyten is een duidelijk aviair kenmerk dat niet wordt gezien in moderne reptielen (maar zie ref. 20).

Epidermale morfogenese en differentiatie worden geacht te zijn gedivergeerd in therapsiden en sauropsiden31. Onze gegevens ondersteunen andere aanwijzingen dat gedeelde epidermale kenmerken bij vogels en zoogdieren wijzen op convergente evolutie43 en suggereren dat lipiderijke corneocyteninhoud evolutionair afgeleide kenmerken kunnen zijn bij vogels en gevederde niet-avische maniraptoranen. Evo-devo studies hebben gesuggereerd dat de aviaire epidermis zou kunnen zijn ontstaan uit de uitbreiding van scharniergebieden in ‘protofeather’-dragende geschubde huid20. Hoewel fossiele bewijzen voor deze overgang ontbreken, tonen onze gegevens aan dat de epidermis van basale vogels en niet-avische maniraptor-dinosauriërs al een uitgesproken modern karakter had ontwikkeld, zelfs bij taxa die niet tot vliegen in staat zijn. Dit sluit de mogelijkheid niet uit dat tenminste enkele van de hier beschreven epidermale kenmerken hun oorsprong vinden bij meer basale theropoden, vooral wanneer de bewaarde huid geen sporen van schubben vertoont (zoals bij Sciurumimus44). Verfijnde genomische mechanismen voor het moduleren van de complexe expressie van keratine in de epidermis45, de terminale differentiatie van keratinocyten en de verdeling van α- en β-keratinesynthese in de huid van gevederde dieren32 werden waarschijnlijk gewijzigd in combinatie met de vetevolutie dicht bij de basis van de Maniraptora tegen het late Midden Jura (Fig. 4). Bestaande fossiele gegevens suggereren dat dit gebeurde na de evolutie van de snavel bij Maniraptoriformes en vóór de evolutie van de voorpoot patagia en pterylae (Fig. 4); de eerste fossiele voorkomens van al deze kenmerken bestrijken een tijdspanne van ca. 10-15 Ma, wat wijst op een uitbarsting van innovatie in de evolutie van gevederde integument dicht bij en over de grens tussen het Onder-Midden Jura. Het vroegste bewijs voor dermale musculatuur geassocieerd met veren is ca. 30 Ma jonger, in een 125 Ma ornithothoraceeën vogel17. Gezien de essentiële rol die dit huidnetwerk speelt bij de ondersteuning van de veren en de controle van de veeroriëntatie18 , kan de afwezigheid ervan bij gevederde niet-avische maniraptoranen een taphonomische bias weerspiegelen.

In bepaalde opzichten zijn de fossiele corneocyten duidelijk niet-aviaans en wijzen erop dat gevederde dinosauriërs en vroege vogels een unieke integumentaire anatomie en fysiologie hadden die een overgang vormde tussen die van moderne vogels en niet-gevederde dinosauriërs. Bij levende vogels liggen de tonofibrillen van de hoorncellen losjes verspreid tussen de intracellulaire lipiden19 ; dit vergemakkelijkt de verdampingskoeling als reactie op de warmteproductie tijdens de vlucht en de isolatie door het verenkleed46. De fossiele tonofibrillen daarentegen zijn dicht opeengepakt en vullen de celinhoud. Er zijn geen aanwijzingen voor postmortale krimp van de fossiele corneocyten: de grootte komt overeen met die van moderne vogels, en er zijn geen aanwijzingen voor diagenetische rimpelvorming, vervorming of scheiding van afzonderlijke cellen. Dit wijst er sterk op dat de bewaard gebleven dichtheid van tonofilamenten in de fossiele corneocyten een oorspronkelijk hogere dichtheid weerspiegelt dan bij de huidige vogels. Dit is geen functie van de lichaamsgrootte: bij vogels van verschillende grootte (b.v. de zebravink en de struisvogel) zijn de tonofibrillen losjes verspreid47. De fossiele vogels hadden dus waarschijnlijk een lagere fysiologische behoefte aan verdampingskoeling en, op hun beurt, een lagere lichaamswarmteproductie in verband met vliegactiviteit46 dan moderne vogels. Dit is in overeenstemming met andere aanwijzingen voor een laag basaal metabolisme bij niet-avische maniraptor-dinosauriërs47,48 en basale vogels47 en met hypotheses dat de veren van Microraptor49 en, mogelijk, Confuciusornis48 (maar zie ref. 50) niet aangepast waren aan gemotoriseerd vliegen, althans niet voor langere perioden50.