Introductie
Hepatitis B virus (HBV) infectie is de meest voorkomende oorzaak van levercirrose en hepatocellulair carcinoom in de meeste delen van Azië.1,2 De pathogenese van chronische hepatitis wordt gemedieerd door de interactie tussen de immuunreactie van de gastheer en de hepatocyten die HBV-antigenen presenteren.3,4 Eerdere studies hebben aangetoond dat de expressie van HBV-antigenen door hepatocyten in belangrijke mate samenhangt met het stadium en de activiteit van de chronische leverziekte. In de immuuntolerantiefase worden hepatitis B-antigenen (HBcAg) voornamelijk in de kern aangetroffen en gecorreleerd met HBV-replicatie, terwijl in de daaropvolgende immuunklaringsfase een intrahepatische verschuiving van HBcAg van de kern naar het cytoplasma optreedt en geassocieerd wordt met de histologische activiteit van chronische hepatitis.5,6 In gevallen van intrahepatische hepatitis B-oppervlakte-antigeen (HBsAg)-expressie zijn drie patronen gerapporteerd: een homogeen type, een type I ground glass hepatocyte (GGH), en een type II GGH. Homogene patronen in gegroepeerde, discrete, of vage presentaties zijn waargenomen bij patiënten met hoge viremie of actieve hepatitis. Type I GGH’s zijn typisch afzonderlijk verspreid in leverkwabben met inclusie-achtige dichte homogene expressie, terwijl type II GGH’s oppervlakte-antigenen tot expressie brengen aan de periferie van hepatocyten, die clusteren in groepen, en over het algemeen aanwezig zijn tijdens de lage replicatiefase en prevalent worden vanaf actieve hepatitis tot levercirrose en hepatocellulair carcinoom.7-10 Vandaar dat zowel intrahepatische HBcAg als HBsAg expressies nauw verbonden zijn met het natuurlijk verloop van de infectie en HBV replicatie.
Onder de fasen van chronische hepatitis B kwam de immuunzuivere fase of aangeduid als HBeAg-positieve chronische hepatitis B vaak voor bij jongere bevolkingsgroepen, vertoonde minder ernstige histologische activiteiten, en herbergde minder percentages van precore A1896-mutatie en basale kernpromotor (BCP) T1762/A1764-mutaties dan HBeAg-negatieve chronische hepatitis B.11-14 Het verloop van chronische hepatitis B is dynamisch en het resultaat van de interactie tussen virale replicatie en het immuunsysteem van de gastheer. Bijgevolg worden bij HBeAg-positieve patiënten vaak verschillen in klinische kenmerken of histologische activiteiten waargenomen. Zo vertoont 34 tot 55% van de patiënten overbruggingsfibrose of cirrose in de leverhistologie, terwijl de overige patiënten milde fibrose vertonen.15,16 Er is aangetoond dat HBsAg-accumulatie in hepatocyten samenhangt met specifieke virale mutaties en samenhangt met ziekteactiviteit.8,9 Het is interessant om de kenmerken van intrahepatische HBsAg-expressie te onderzoeken bij patiënten met een verschillende ernst van leverhistologie.
Virale mutanten evolueerden gewoonlijk onder druk van het immuunsysteem van de gastheer. Onder de natuurlijk voorkomende HBV-mutanten werden BCP T1762/A1764-mutaties prevalent naarmate de ziekte voortschreed en zij bleken vaak geassocieerd te zijn met gevorderde leverziekte en hepatocellulair carcinoom.17,18 Patronen van intrahepatische HBsAg expressie veranderden ook tijdens het natuurlijke beloop van chronische hepatitis B. De associatie van BCP T1762/A1764 mutaties en de intrahepatische HBsAg expressie is nog onbekend en moet nog onderzocht worden.
Daarom was het doel van deze studie om de kenmerken van intrahepatische HBsAg expressie te evalueren en de associatie te analyseren met leverhistologie, virale replicatie markers, en HBV mutanten in HBeAg positieve chronische hepatitis B.
Materiaal en MethodenPatiënten
Er werden in totaal 181 behandeling-naïeve hepatitis B e antigeen (HBeAg) positieve patiënten die voldeden aan de inclusie criteria retrospectief ingeschreven in deze studie. De inclusiecriteria waren een leeftijd van meer dan 18 jaar en minder dan 70 jaar, positief serum HBsAg gedurende meer dan 6 maanden en serum HBV DNA niveau ≥ 100.000 kopieën/mL, abnormaal serum alanine aminotransferase niveau, geen andere verklaarbare etiologie van chronische hepatitis, inclusief alcohol, auto-immuun hepatitis of markers van hepatitis C virus, hepatitis D virus, of humaan immunodeficiëntie virus infectie, en het ontbreken van een voorgeschiedenis van anti-HBV behandeling en een leverbiopsie beschikbaar voor histologische evaluatie. Het serum en de leverbiopsie van alle patiënten werden bemonsterd vóór de antivirale behandelingen, en de monsters werden bewaard bij -70 oC tot de testen. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het National Cheng Kung University Hospital (nr: ER-99-398). Er werd geïnformeerde toestemming verkregen, volgens de Verklaring van Helsinki.
HBV virologische tests
HBV genotypering werd uitgevoerd door de multiplex polymerase kettingreactie, zoals elders beschreven.19 Serum HBV DNA niveau werd gemeten met behulp van de COBAS Amplicor HBV Monitor test (COBAS-AM assay, Roche Diagnostics, Branchburg, NJ). Het serum HBsAg-niveau werd gekwantificeerd met Abbott Architect HB-sAg QT (Abbott Diagnostics, Rungis, Frankrijk) met een dynamisch bereik van 0,05-250,0 IU/mL. Monsters met HBsAg niveaus > 250 IU/mL werden opnieuw getest in verdunningen van 1:20 en 1:1000.
Polymerase chain reaction en sequencing van precore en BCP regio’s
HBV DNA werd geëxtraheerd uit 50 μL serum met behulp van Blood and Tissue Genomic Mini Kit (VIOGENE, Taipei, Taiwan). Eerste ronde PCR werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: 96 oC gedurende 2 min, 94 oC gedurende 1 min, 54 oC gedurende 1 min, en 72 oC gedurende 2 min met primers 5′-ACCTCTGCACGTAGCATGG (forward) en 3′-GGATTAAAGACAGGTACAGTAGAAG (reverse). Een tweede ronde PCR werd onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd met de primers 5′-ATGTCAACGACCGACCTTGA (forward) en 3′-TTCCCACCTTATGAGTCCAAG (reverse). Gezuiverde PCR-producten werden vervolgens direct gesequeneerd met behulp van een geautomatiseerde DNA-sequencer ABI 310 en de ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) met de voorwaartse primer die tijdens de tweede-ronde PCR werd gebruikt.
Liverhistologie
Liverhistologie werd beoordeeld door één patholoog die niet op de hoogte was van de achtergrond van de patiënten. Necro-inflammatie en fibrose werden geëvalueerd op basis van de Knodell necro-inflammatie graad (variërend van 0 tot 18)20 en de Ishak fibrose stadium (variërend van 0 tot 6),21 respectievelijk.
Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd zoals elders beschreven.22 Kort samengevat werden gedeparaffineerde 5 μm dikke secties geïncubeerd met monoklonale muis anti-HBsAg (Kloon 3E7, Dako Corp., Carpinteria, USA) en anti-HBcAg (Novocastra Laboratories, Newcastle, UK) gedurende een nacht bij 4°C. De optimale verdunning van anti-HBsAg of anti-HBcAg werd bepaald met leverweefsel van HBV-dragers als positieve controle. De StrAviGen Super Sensitive MultiLink Kit (BioGenex) werd gebruikt om het resulterende immuuncomplex op te sporen. De peroxidaseactiviteit werd gevisualiseerd met een aminoethylcarbazoolsubstraatkit (Zymed Laboratory, Inc, San Francisco, CA). Ten slotte werden de coupes tegengekleurd met hematoxyline. Als negatieve controle werd niet-immuun muisimmunoglobuline in de incubatie vervangen door primair antilichaam. Patronen van HBcAg expressie door de kern, het cytoplasma, of beide, werden geregistreerd. Patronen van HBsAg-expressie werden geclassificeerd als homogeen, type I GGH, type II GGH.22 Homogeen gekleurde hepatocyten werden geïdentificeerd als hepatocyten met matige tot sterke homogene cytoplasmatische kleuring; type I GGH’s werden geïdentificeerd als hepatocyten met dichte bolvormige of ‘inclusie-achtige’ kleuring, en type II GGH’s werden geïdentificeerd als hepatocyten met oppervlakte-antigeenkleuring aan de randen of periferie van de cel.6,22 Type I GGH’s liggen afzonderlijk verspreid of geclusterd in de leverkwabben, terwijl type II GGH’s consequent geclusterd zijn in knobbels. De expressieniveaus van HBcAg en HBsAg werden semi-kwantitatief gescoord volgens de proportie van geïmmunolabelde cellen, op een schaal van 0 tot 4+, wat overeenkomt met positiviteit in 0, 1-10, 11-25, 25-50% en meer dan 50% van de onderzochte hepatocyten.
Statistische analyses
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Continue variabelen werden vergeleken met behulp van de Mann-Whitney U test of Kruskal-Wallis ANOVA voor univariate analyse. Categorische variabelen werden geanalyseerd met behulp van χ2-test of Fisher’s exact test. Onafhankelijke factoren die geassocieerd waren met niveaus van intrahepatische HBsAg expressie werden uitgevoerd met behulp van multivariate logistische regressie analyse. De gegevensverwerking en statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de SPSS-software voor Windows, versie 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
ResultatenKarakteristieken van de ingeschreven patiënten
Tabel 1 geeft een overzicht van de demografische kenmerken van de 181 ingeschreven patiënten. De meeste patiënten waren mannen (69,1%) en 63,0% van hen vertoonde HBV-genotype C. De precore A1896-mutatie werd gedetecteerd bij 20 patiënten (11,0%) en de BCP T1762/A1764-mutaties werden gedetecteerd bij 38 patiënten (21,0%). Van de 181 patiënten werd een positieve HB-sAg-kleuring vastgesteld bij 105 patiënten (58,0%). Patiënten met HBsAg-kleuring vertoonden een significant hoger serum HBsAg (P
Clinische, virologische en histologische kenmerken van de 181 patiënten.
| Karakteristieken | Waarde | |||
|---|---|---|---|---|
| HBsAg expressie | P waarde | |||
| Alle patiënten (n = 181) | Negatief (n = 76) | Positief (n = 105) | ||
| Leeftijd (jr) ± SD | 36.4 ± 10.5 | 34.2 ± 9.2 | 38.0 ± 11.2 | 0.009 |
| Geslacht (man/vrouw) | 125/56 | 50/26 | 75/30 | 0.418 |
| gemiddelde AST-spiegel (U/L) ± SD | 59,7 ± 51,2 | 58,7 ± 42,5 | 60,5 ± 56.8 | 0.634 |
| gemiddelde ALT-spiegel (U/L) ± SD | 116.3 ± 124.2 | 120.2 ± 100.8 | 113.5 ± 139.1 | 0.282 |
| HBV-genotype (B/C) | 114/67 | 66/10 | 48/57 | |
| Precore: G1896/A1896 | 20/161 | 13/63 | 7/98 | 0.027 |
| BCP:* mutant/wild | 38/143 | 12/64 | 26/79 | 0.144 |
| HBV DNA (log kopieën/mL) | 8.4 ± 1.1 | 4.0 ± 0.7 | 4.3 ± 0.7 | |
| HBsAg-niveau ((log IU/mL) | 4.2 ± 0.7 | 8.1 ± 1.0 | 8.6 ± 1.1 | 0.003 |
| Mean Knodell necroinflammation grade ± SD | 5.0 ± 3.0 | 5.3 ± 2.8 | 4.7 ± 3.0 | 0.128 |
| Mean Ishak fibrosis stage ± SD | 1.8 ± 1.6 | 1.7 ± 1.2 | 1.9 ± 1.7 | 0.703 |
| 0.703 | ||||
Mutant, T1762 en A1764; wild, A1762 en T1764. χ2 test werd gebruikt voor variabelen van geslacht, HBV genotype, precore en basal core promoter mutaties, terwijl Mann-Whitney U test werd gebruikt voor andere variabelen. AST: aspartaat aminotransferase. ALT: alanine aminotransferase. BCP: basale kern promotor. HBV: hepatitis B-virus.
Distributiepatronen van HBsAg-expressie
Van de 105 patiënten die HBsAg-expressie vertoonden, werd een homogeen patroon (figuur 1A) gedetecteerd bij 34 (32.4%) patiënten, type I GGH (figuur 1B) werd gedetecteerd in die van 50 (47,6%), type II GGH (figuur 1C) werd gedetecteerd in die van zeven (6,7%), en een gemengd patroon werd gedetecteerd in die van 14 (13,3%). Zoals aangegeven in tabel 2, werd een hogere prevalentie van BCP T1762/A1764-mutaties waargenomen in type II GGH (P =0,001) in vergelijking met andere patronen. Er was een wederkerige relatie tussen HBsAg expressie en serum virale replicatie markers. In figuur 1D is te zien dat patiënten met type II GGH expressie lagere HBV DNA niveaus en HBsAg titers hadden, maar hogere intrahepatische HBsAg expressie niveaus (figuur 1D). Bovendien vertoonde de leverhistologie type II GGH significant ernstiger levernecroinflammatie en fibroseactiviteiten, en een hoger niveau van intrahepatische HBsAg-expressie (figuur 1E).
Bevattende patronen van HBsAg. A. Enkele matig tot sterk homogeen cytoplasmatisch HBsAg-gekleurde hepatocyten (pijlen) op een achtergrond van zwak gekleurde hepatocyten. De kern van elke homogeen gekleurde hepatocyt bevond zich in het centrum van de cel. B. Type I ground glass hepatocyte (GGH) met dichte bolvormige of “inclusie-achtige” HBsAg-kleuring (pijlen) was verspreid in het leverparenchym. C. Een cluster van type II GGH’s vertoonde HBsAg-kleuring aan de celrand of periferie. Correlaties van HBsAg-expressiepatronen en serum HBV DNA-niveau (Da), serum HBsAg-niveau (Db), en intrahepatisch HBsAg-expressieniveau (Dc). De associatie van HBsAg expressiepatronen en Knodell necro-inflammatie graad (Ea) en Ishake fibrose stadium (Eb). Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd met Kruskal-Wallis ANOVA.
Demografische kenmerken naar distributiepatronen f HBsAg expressie.
| HBsAg-patroon (n = 105) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Gemengd (n = 14) | Homogene | Type I GGH | Type II GGH | P waarde | |
| (n = 34) | (n = 50) | (n = 7) | |||
| Leeftijd (jr) ± SD | 36.3 ± 9.2 | 36.3 ± 10.0 | 39.2 ± 12.7 | 40.0 ± 7.9 | 0.104 |
| Geslacht (man/vrouw) | 11/3 | 26/11 | 35/15 | 6/1 | 0.720 |
| gemiddelde AST-gehalte (U/L) ± SD | 64,9 ± 56,5 | 61,1 ± 38,6 | 49,9 ± 28,3 | 122.4 ± 168.7 | 0.474 |
| gemiddelde ALT-spiegel (U/L) ± SD | 116.7 ± 112.4 | 114.6 ± 91.1 | 91.5 ± 63.8 | 259.1 ± 447.6 | 0.651 |
| HBV genotype (B/C) | 10/4 | 15/19 | 22/28 | 1/6 | 0.085 |
| Precore: G1896/A1896 | 0/14 | 3/31 | 4/46 | 0/7 | 0.594 |
| BCP:* mutant/wild | 4/10 | 4/30 | 12/38 | 6/1 | 0.001 |
| HBV DNA (log kopieën/mL) | 3.9 ± 1.0 | 4.5 ± 0.5 | 4.4 ± 0.7 | 3.6 ± 0.5 | 0.001 |
| HBsAg-niveau ((log IU/mL) | 8.2 ± 1.1 | 8.9 ± 0.7 | 8.7 ± 1.1 | 6.9 ± 1.5 | |
| Knodell necroinflammation graad ± SD | 4.2 ± 2.9 | 4.2 ± 3.3 | 4.7 ± 2.7 | 8.6 ± 2.0 | 0.003 |
| Ishak fibrosis stadium ± SD | 1.9 ± 1.9 | 1.5 ± 1.3 | 4.1 ± 1.5 | 0.007 |
Mutant, T1762 en A1764; wild, A1762 en T1764. χ2 test werd gebruikt voor variabelen van geslacht, HBV genotype, precore en basal core promoter mutaties, terwijl Mann-Whitney U test werd gebruikt voor andere variabelen. AST: aspartaat aminotransferase. ALT: alanine aminotransferase. BCP: basale kern promotor. HBV: hepatitis B-virus.
HBsAg-expressieniveau
Figuur 2A tot 2D toont de illustratie van de semikwantitatieve meting van HBsAg-expressie. Er was geen enkele patiënt met schaal 4+ van HBsAg expressie in deze studie. Er werd een wederkerige relatie tussen virale replicatie en leverhistologie waargenomen. Patiënten met 2+/3+ schalen van HBsAg expressie hadden lagere HBsAg titers en HBV DNA niveaus, maar significant ernstiger necroinflammatie graad en fibrose stadium dan patiënten met 1+ schaal van HBsAg expressie en negatieve HBsAg kleuring (Figuur 2E). De patiënten met Knodell necro-inflammatie graad ≥ 5 score of Ishake fibrose stadium ≥ 1 hadden significant hogere percentages van HBsAg expressie (figuur 3).
HBsAg-expressie semi-kwantitatief gemeten aan de hand van de proportie geïmmunolabelde cellen, op een schaal van 0 tot 3+, overeenkomend met positiviteit in (A) 0% (0), (B) 1-10% (C) 11-25% (2+), en (D) 25-50% (3+) van de onderzochte hepatocyten. Correlaties van HBsAg expressieniveau en serum HBV DNA (Ea) en HBsAg niveaus (Eb), en Knodell necro-inflammatie graad (Ec) en Ishak fibrose stadium (Ed). Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd door Kruskal-Wallis ANOVA.
Correlatie van de expressie van intrahepatisch HBsAg met Knodell necro-inflammatie graad (A) en Ishak fibrose stadium (B). Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd met Mann-Whitney U test.
Clinische kenmerken van HBsAg expressie
Vooreerst onderzochten we de associatie van virale factoren en HBcAg/HBsAg expressie. HBsAg-expressie, niet HBcAg-expressie, vertoonde een significant lager niveau in de aanwezigheid van precore-mutatie (P = 0,001). Patiënten met genotype C vertoonden een groter leverfibrosestadium (P = 0,004). Bij patiënten met BCP T1762/A1764-mutaties was er een significant hogere necro-inflammatiegraad en fibrosestadium, en een lagere HBcAg-expressie, hetzij in cytoplasma of in de celkern. Al deze waarnemingen duidden op een actieve leverschade. Bovendien vertoonden patiënten met BCP T1762/A1764 mutaties een hogere intrahepatische HBsAg expressie (9,3 ± 8,0% vs. 4,3 ± 5,0%, P = 0,008) (Tabel 3). Verder onderzochten we factoren die verband kunnen houden met het niveau van HB-sAg expressie. In tabel 4, waren er 16 patiënten met 2+/3+ schalen van HBsAg expressie en 1+ schaal in die van 89 patiënten. Een univariate analyse toonde aan dat 2+/3+ schalen van HBsAg expressie geassocieerd was met BCP T1762/A1764 mutaties, en ernstiger levernecroinflammatie en -fibrose. Een multivariate regressieanalyse toonde aan dat de BCP T1762/A1764-mutaties de onafhankelijke factor was die geassocieerd was met 2+/3+-schalen van intrahepatische HBsAg-expressie.
Klinische, virologische en histologische kenmerken van patiënten met of zonder virale mutaties.
| Precore mutatie | P waarde | BCP mutaties | P waarde | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nee (n = 98) | Ja (n = 7) | Nee (n = 79) | Ja (n = 26) | ||||
| Leeftijd (jr) ± SD | 37.8 ±11.0 | 40.0 ± 13.7 | 0.541 | 36.0 ± 10.6 | 43.8 ±11.1 | 0.005 | |
| Geslacht (man/vrouw) | 70/28 | 5/2 | 1.000 | 54/25 | 21/5 | 0.000 | 0.005 |
| .318 | |||||||
| gemiddelde AST-gehalte (U/L) ± SD | 60,0 ± 58,3 | 71,3 ± 30,5 | 0,072 | 51,5 ± 32,1 | 87,3 ± 95.6 | 0.007 | |
| Gemiddelde ALT-spiegel (U/L) ±SD | 112.2 ± 143.6 | 131.6 ± 39.1 | 0.031 | 98.2 ± 77.9 | 160.0 ± 242.0 | 0.080 | |
| HBV-genotype (B/C) | 45/53 | 3/4 | 1.000 | 44/35 | 4/22 | ||
| V-genotype (B/C) | Precore: G1896/A1896 | 6/73 | 1/25 | 0.678 | |||
| BCP:* mutant/wild | 25/73 | 1/6 | 0.678 | ||||
| BCP:* mutant/wild | 25/73 | 1/6 | 0.678 | ||||
| HBV DNA (log kopieën/mL) | 3.9 ± 1.0 | 4.5 ± 0.5 | 0.959 | 4.5 ± 0.6 | 3.7 ± 0.6 | ||
| HBsAg-gehalte ((log IU/mL) | 8.2 ± 1.1 | 8.9 ± 0.7 | 0.892 | 8.8 ± 0.9 | 7.7 ± 1.4 | ||
| Knodell necroinflammation grade ± SD | 4.6 ± 3.0 | 6.1 ± 3.1 | 0.142 | 3.9 ± 2.7 | 7.2 ± 2.7 | ||
| Ishak fibrosis stage ± SD | 1.8 ± 1.8 | 2.1 ± 0.9 | 0.286 | 1.3 ± 1.4 | 3.4 ± 1.6 | ||
| HBcAg cytoplasmatische expressie (%) | 53.6 ± 25.8 | 44.3 ± 30.5 | 0.402 | 56.3 ± 25.4 | 42.7 ± 25.8 | 0.018 | |
| HBcAg nucleaire expressie (%) | 13.5 ± 17.3 | 17.6 ± 31.6 | 0.800 | 17.6 ± 20.0 | 2.3 ±4.1 | ||
| HBsAg expressie (%) | 5.8 ± 6.5 | 2.4 ± 1.5 | 0.274 | 4.3 ± 5.0 | 9.3 ± 8.0 | 0.003 | |
Mutant, T1762 en A1764; wild, A1762 en T1764. χ2 test werd gebruikt voor variabelen van geslacht, HBV genotype, precore en basal core promoter mutaties, terwijl Mann-Whitney U test werd gebruikt voor andere variabelen. AST: aspartaat aminotransferase. ALT: alanine aminotransferase. BCP: basale kern promotor. HBV: hepatitis B-virus.
De associatie van demografische kenmerken en de mate van HBsAg-expressie.
| Univariate | Multivariate | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| HBsAg expressie, schaal | 1+ (n = 89) | 2+/3+ (n = 16) | P waarde | Odds ratio (95% CI) | P waarde | |
| Leeftijd | 38.2 ±11.2 | 36.6 ±11.1 | 0.608 | 0.963 (0.903-1.026) | 0.242 | |
| Geslacht (man/vrouw) | 63/26 | 12/4 | 1.000 | |||
| AST-gehalte (U/L) | 55,0 ± 37,7 | 90,4 ± 113,2 | 0,234 | 1,026 (0,991∼1.063) | 0.142 | |
| ALT-gehalte (U/L) | 103.3 ± 84.4 | 170.1 ± 297.2 | 0.386 | 0.991 (0.978∼1.005) | 0.216 | |
| HBV genotype (B/C) | 42/47 | 6/10 | 0.589 | 0.994 (0.234∼4.231) | 0.994 | |
| Precore A1896 mutatie (+/-) | 7/82 | 0/16 | 0.592 | 0.000 (0.000∼) | 0.999 | |
| BCP:*mutant/Wild | 17/72 | 9/7 | 0.003 | 6.356 (1.204∼33.356) | 0.029 | |
| HBsAg-gehalte (log10IU/mL) | 4,3 ± 0,7 | 4,2 ± 0,8 | 0,180 | 2,096 (0,598∼7,349) | 0.247 | |
| Serum HBV DNA (log10 kopieën/mL) | 8,6 ± 1,1 | 8,1 ± 1,4 | 0,135 | 0,731 (0,386∼1,383) | 0.335 | |
| Knodell necroinflammation grading | 4.4 ± 2.9 | 6.3 ± 3.3 | 0.027 | |||
| Ishak fibrosis stage | 1.7 ± 1,6 | 2,9 ± 2,1 | 0,041 | |||
| HBcAg cytoplasmatische expressie (%) | 53.1 ± 25.8 | 52.3 ± 28.5 | 0.915 | |||
| HBcAg nucleaire expressie (%) | 14.4 ± 18.3 | 10.1 ± 19,3 | 0,389 | |||
Mutant, T1762 en A1764; wild, A1762 en T1764. Univariate analyse: χ2-test werd gebruikt voor variabelen van geslacht, HBV-genotype, precore en basale core promotormutaties, terwijl Mann-Whitney U-test werd gebruikt voor andere variabelen. Multivariate analyse: Logistische regressieanalyse uitgedrukt als Odds ratio met 95% betrouwbaarheidsinterval en P-waarden. AST: aspartaat aminotransferase. ALT: alanine aminotransferase. BCP: basale kern promotor. HBV: hepatitis B-virus.
Discussies
Intrahepatische HBsAg-expressie is geassocieerd met verschillende replicatieve stadia en ziekte-evolutie tijdens het natuurlijke beloop van chronische hepatitis B.7,10,23 Type I GGH komt voornamelijk voor in het stadium van actieve hepatitis, terwijl type II GGH voornamelijk voorkomt in het stadium van inactieve hepatitis of cirrose.8 In deze studie hebben wij aangetoond dat type II GGH geassocieerd is met een ernstiger leverhistologie, die gepaard gaat met significant lagere serum HBV DNA-spiegels en HBsAg-titers, en relatief hogere niveaus van intrahepatische HBsAg-expressie. Deze wederkerige relatie tussen leverhistologie en HBV-replicatie gaf aan dat het voorkomen van type II GGH een marker zou kunnen zijn van gevorderde leverziekte tijdens de evolutie van de ziekte in HBeAg-positieve chronische hepatitis B. Patronen van HB-sAg expressie zijn in verband gebracht met verschillende virale mutaties die invloed hebben op de regulatie van HBV-replicatie en het defect van de secretie van het oppervlakte-antigeen uit hepatocyten.9,24 Type II GGH bevatte consequent Pre-S2 deletiemutaties die de synthese van de middelste oppervlakte-eiwitten verminderden en vervolgens resulteerden in accumulatie van grote oppervlakte-eiwitten in hepatocyten en defect van HBsAg secretie.25 In deze studie hebben we correlatie van serum HBsAg en HBV DNA uitgevoerd tussen patiënten met en zonder type II GGH. Matige correlatie tussen de twee HBV-replicatie-indicatoren werd aangetroffen bij patiënten zonder type II GGH (r = 0,686, P 26,27 Pre-S deletie zou kunnen leiden tot ER stress en stress-gerelateerde signaaltransductie kunnen activeren. Oxidatieve beschadiging van hepatocyten-DNA en vervolgens gestimuleerde DNA-herstelmechanismen zouden kunnen resulteren in genomische instabiliteit die de leverschade verergert en vatbaar is voor carcinogenese.28
Naast patronen van HBsAg-expressie vonden we dat hogere expressieniveaus gepaard gingen met ernstiger leverhistologische activiteiten en een hoger percentage van BCP T1762/A1764-mutaties. BCP T1762/A1764-mutaties zijn sterk geassocieerd met ernstige leverhistologische activiteiten en leverkanker.29,30 Voor zover wij weten, is er een sterk verband tussen genotype C en de aanwezigheid van BCP T1762/ A1764-mutaties.30 In deze studie leek genotype C geen rol te spelen in het HBsAg-expressieniveau. Daarentegen bleken BCP T1762/A1764 mutaties sterk samen te hangen met de HBsAg expressie. Met betrekking tot virale mutatie kunnen BCP T1762/A1764-mutaties de basis vormen voor andere HBV-mutaties, waaronder pre-S deletie en complexe mutaties die vaak voorkomen in de aanwezigheid van BCP T1762/A1764-mutaties. Complexe HBV-mutanten vertoonden gedeeltelijke of volledige defecten in e-, kern- en oppervlakte-eiwitexpressie en -secretie.31 De verminderde secretie van hepatitis B-oppervlakte-antigeen correleerde met een afwijkende lokalisatie van oppervlakte-eiwitten in het ER en resulteerde in een hoge expressie van HBsAg. Bovendien wordt de BCP T1762/A1764 mutatie beschouwd als een gevolg van virale fitness als gevolg van selectiedruk van de immuunbewaking van de gastheer. Evenzo vallen pre-S2-mutaties, die zich in type II GGH bevinden, samen met de humaan leukocytenantigeen-restricted T- en B-cel epitopen.32 Er is meestal geen celnecrose of T-lymfocyteninfiltratie rond de type II GGH’s, wat suggereert dat HBV met het ontstaan van de pre-S2-deletiemutatie ook een mogelijk nieuwe escape-mutant is.33 De accumulatie van oppervlakte-antigeen in hepatocyten zou echter kunnen plaatsvinden zonder drager te zijn van een van de bekende virale mutaties in pre-S- of S-genomen of in oppervlaktepromotors.31,34 Daarom zou HBsAg-expressie een sequentie kunnen zijn in associatie met of zonder virale mutaties.
Deze studie had verschillende mogelijke beperkingen. De waarnemingen in deze studie waren gebaseerd op een retrospectief cross-sectioneel design, maar er werd geen longitudinale follow-up uitgevoerd. Het expressieniveau van HBsAg in hepatocyten en de histologische ernst kunnen variëren tussen verschillende delen van de lever bij één patiënt; leverbiopsie op zich kan geen leverweefsel exact representeren, behalve de biopsiekern.
Samenvattend vertoonden patiënten met type II GGH-patroon of hogere niveaus van intrahepatische HBsAg-expressie de wederkerige relatie tussen ernstiger leverhistologische activiteiten en lagere HBV-replicatiecapaciteit. De sterke associatie tussen intrahepatische HBsAg expressie en BCP T1762/A1764 mutaties gaf aan dat HBsAg expressie mogelijk kan worden beschouwd als de histologische manifestatie tijdens HBV genomische evolutie onder gastheer immuundruk.
Afkortingen
- –
BCP: basal core promoter.
- –
GGH: ground glass hepatocyte.
- –
HBcAg: hepatitis B core antigen.
- –
HBeAg: hepatitis B e antigen.
- –
HBsAg: hepatitis B oppervlakte-antigeen.
- –
HBV: hepatitis B virus.
Conflicts of Interest
T.-T. C. heeft onderzoeksgelden ontvangen van Gilead Sciences, Bristol-Myers Squibb Company, Glaxo-SmithKline, Merck Sharp & Dohme (I.A.) Corporation en Pfizer Inc. Er is geen belangenconflict voor de overige auteurs.