Is cDNA eenstrengs of tweestrengs ? – (09 feb/2006 )

Hallo,
Ik heb mijn vraag elders gepost maar kreeg geen antwoord, ik wil hem hier posten en, sorry dat het een domme vraag lijkt, want ik ben echt in de war !
Ik las ergens iets over cDNA dat me verbijsterd. Ik zou graag willen weten of cDNA een dubbelstrengs of een enkelstrengs is?
Ik weet dat cDNA de kopie is van mRNA door reverse transcriptase dus, theoretisch, zou het een enkelstrengs zijn, toch of vergis ik me?
Dank voor uw feedback

Voor de meeste gevallen, zoals voor RT-PCR, 3 ‘of 5’ RACE, gebruiken we gewoon enkelstrengs cDNA (de eerste streng cDNA), terwijl in het geval van de voorbereiding van de cDNA voor de bouw van de bibliotheek, of RDA / SSSH analyse die extra tweede streng synthese stap voor het genereren van dubbelstrengs cDNA nodig zou kunnen hebben.

hi
u moet 2 dingen onderscheiden:
cDNA in het algemeen is de DNA-molecule die ruwweg overeenkomt met de mRNA seuqentie. Het is dus een dubbelstrengs molecule die in de meeste gevallen in een plasmide wordt opgenomen voor expressie.
RT PCR : de mRNA molecule wordt omgekeerd getranscribeerd in cDNA enkelstrengs. Daarna verwijdert RNase de mRNA-molecule en krijgt men een enkelstrengs cDNA-molecule. Aangezien de volgende stap een vrij klassieke PCR is, is een enkele streng ok voor de exp (en de eerste stap, die overeenkomt met sysnthesis van de corrsepondente tweede streng van een DNA-molecule herstelt de echte cDNA molecule.
Om juist te zijn, cDNA is een dubbelstrengs molecule, maar voor het gemak wordt cDNA ook gebruikt voor het ontwerpen van de omgekeerd getranscribeerde molecule van de RTPCR. Het zou moeten worden genoemd als half cDNA of enkelstrengs cDNA.
cDNA is een verkorte naam.

terwijl in de meeste gevallen cDNA, afkorting van complementair DNA, wordt gedefinieerd als een enkelstrengs DNA-molecuul met een nucleotidenvolgorde die complementair is aan een RNA-molecuul, en dat in het lab uit mRNA wordt gesynthetiseerd door middel van omgekeerde transcriptie…

Dus, cDNA is enkelstrengs totdat een PCR reactie is uitgevoerd ? Ok, in dit geval, hoe genereert Taq DNA Polymerase een tweede complementaire streng uit slechts een streng ? Wanneer de twee primers annealiseren aan elke kant van dezelfde streng, hoe kunnen zij dan de tweede streng produceren (de nieuwe complementaire streng) ?

In PCR bindt een primer aan een enkelstrengs stuk DNA (dat is waarom de eerste stap altijd is om te dentificeren bij 94C(of zo) om eventuele dubbelstrengs moleculen te scheiden in enkelstrengs. In het geval van het eerstestrengs cDNA van een RT-reactie bindt slechts één primer in de eerste ronde… Dit betekent dat de eerste amplificatieronde in een RT-PCR niet logrithmisch is: u synthetiseert gewoon de tweede streng cDNA. In de volgende ronden (ronde 2 tot ronde n) is er logrithmische amplificatie omdat zowel de voorwaartse als de tegenwaartse primers zich binden aan het gedenatureerde dubbelstrengs sjabloon.
In de eerste ronde denk ik dat het de voorwaartse primer is die bindt… Ik denk dat dit komt omdat mRNA=voorwaartse streng in het genoom en de eerste streng cDNA=complement van mRNA (of is hetzelfde als de omgekeerde streng in het genoom)
Zal iemand mijn logica hier controleren, ik haal mezelf in de war… is dat juist dat het mRNA het complement is van de omgekeerde streng van het genomisch DNA?
ie: mRNA sequentie=voorwaartse streng=5′-3′ sequentie in gDNA (alleen met U niet T)??
HTH

Bedankt voor alles, het is me nu duidelijker.

Ik denk het wel, ja, totdat er een intron wordt aangetroffen, toch ?
We kunnen een van je bekende mRNA-sequenties in NCBI nakijken, de genomische hit terugvinden en de sequenties vergelijken om te zien of het klopt of niet.

Jup dat klopt, je moet de introns overslaan
Lijkt me een goede manier om te testen, zal het later proberen als ik de kans krijg en het je laten weten… hoe meer ik erover nadenk, mRNA-sequentie=voorwaartse strengsequentie moet wel kloppen…
Dank je wel!