Het low density lipoprotein receptor-related protein (LRP), een lid van de low density lipoprotein receptor gen familie, medieert de cellulaire opname van een diversiteit aan liganden. Een vouwchaperon, het 39-kDa receptor-geassocieerd eiwit (RAP), dat zich in de eerste compartimenten van de secretorische route bevindt, remt de binding van alle liganden aan de receptor en kan dienen om voortijdige binding van liganden aan de receptor tijdens de trafficking naar het celoppervlak te voorkomen. Om de moleculaire interacties op te helderen die ten grondslag liggen aan de interactie tussen de receptor, RAP en de liganden, hebben wij de bindingsplaatsen van plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1), weefsel-type plasminogeen activator (t-PA).PAI-1 complexen, RAP, en het anti-LRP Fab fragment Fab A8 geanalyseerd en afgebakend. Daartoe hebben wij een reeks oplosbare recombinante fragmenten gegenereerd die de tweede cluster complement-type herhalingen (C3-C10) en de amino-terminale flankerende epidermale groeifactorherhaling (E4) van LRP omvatten (E4-C10; aminozuren 787-1165). Alle fragmenten werden tot expressie gebracht door stabiel getransfecteerde baby hamster niercellen en gezuiverd door affiniteitschromatografie. Een gedetailleerde studie van de ligandbinding aan de fragmenten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie onthulde de aanwezigheid van drie verschillende, Ca2+-afhankelijke ligandbindingsplaatsen in het cluster II-domein (Cl-II) van LRP. t-PA.PAI-1-complexen en PAI-1 binden zich aan een domein dat zich in het amino-terminale deel van Cl-II bevindt, dat de herhalingen E4-C3-C7 omspant. Aangrenzend aan deze plaats en gedeeltelijk overlappend is een RAP-bindende plaats met hoge affiniteit, gelegen op de herhalingen C5-C7. Fab A8, een pseudo-ligand van de receptor, bindt aan een derde Ca2+-afhankelijke bindingsplaats op de herhalingen C8-C10 aan het carboxyl-terminale uiteinde van Cl-II. Vervolgens hebben we de RAP-gemedieerde remming van ligandbinding aan LRP en aan Cl-II bestudeerd. Zoals verwacht, zagen we een sterke remming van t-PA.PAI-1 complex en Fab A8 binding aan LRP door RAP (IC50 congruent met 0,3 nM), terwijl in het omgekeerde experiment de competitie van t-PA. PAI-1 complexen en Fab A8 voor binding van RAP aan LRP alleen kon worden aangetoond bij hoge concentraties van de concurrenten (>/=1 microM). Interessant is dat, hoewel de evenwichtsdissociatieconstanten voor de binding van RAP aan LRP en aan Cl-II vergelijkbaar zijn, de binding van de liganden aan Cl-II alleen door RAP wordt verhinderd bij concentraties die ten minste 2 orden van grootte hoger zijn dan de concentraties die nodig zijn voor remming van de ligandbinding aan LRP. Onze resultaten pleiten voor modellen die RAP-geïnduceerde allosterische remming van ligandbinding aan LRP voorstellen, waarvoor LRP-moieties nodig kunnen zijn die zich buiten Cl-II van de receptor bevinden.