Sinds de baanbrekende ontdekkingen van de basisprincipes die aan moleculair klonen ten grondslag liggen, zijn er een aantal kloneringsstrategieën ontwikkeld om de recombinatie van DNA-fragmenten gemakkelijker en sneller te laten verlopen. Lees meer over de meest gebruikte strategieën bij moleculair klonen of krijg uw gewenste gen op een eenvoudige manier in de vector die u wenst met GenEZ™ ORF-klonen. Begin met het zoeken naar uw gen.
Traditioneel klonen
Traditioneel klonen, ook wel PCR klonen genoemd, vereist het gebruik van de polymerase kettingreactie (PCR) om de template-sequentie van belang (meestal het gen van belang) te amplificeren en restrictieplaatsen toe te voegen aan de uiteinden van de sequentie. Restrictie-enzymen worden gebruikt om zowel het sjabloon als de doelvector door te knippen, en DNA-ligase wordt gebruikt om de kleverige uiteinden van het sjabloon en de vector aan elkaar te koppelen. Traditioneel klonen maakt een flexibele manipulatie van de DNA-sequentie mogelijk, waardoor het bouwen van vrijwel elke gewenste constructie wordt vergemakkelijkt. De controlepunten en optimalisatieprocedures die voor traditioneel klonen nodig zijn, kunnen echter omslachtig zijn, en de benodigde reagentia kunnen duur zijn.
TA-klonen
TA-klonen is een van de eenvoudigste vormen van klonen. Bij deze methode worden vectoren met 5′ thymine overhangs gebruikt om PCR-producten op te nemen waaraan extra 3′ adenosine overhangs zijn toegevoegd door de aard van TAQ-polymerase amplificatie. TA-klonering heeft het voordeel dat het gemakkelijk en snel gaat, aangezien er geen restrictiedigestiestap nodig is. Bovendien bevatten TA-kloneringssets reactiebuffers die de voorgemengde vector, ligase en buffer bevatten, waardoor de ligatiereactietijd tot slechts 5 minuten kan worden teruggebracht. Het nadeel van TA-kloneringstechnologie is dat het kloneren niet directioneel is, wat betekent dat het gen van belang in de doelvector kan worden ingevoegd in zowel de sense- als de antisense-oriëntatie. Normaliter zal de helft van de getransformeerde cellen het gen in de sense-richting bevatten en de andere helft het gen in de antisense-richting. Met toxische genen getransformeerde cellen kunnen echter allemaal de genen in de antisense richting bevatten, aangezien cellen die de sense-gerichte genen bevatten, niet zullen overleven. Bovendien kunnen overlevende cellen die toxische genen bevatten die in de zinrichting zijn georiënteerd, worden gemuteerd om voor een minder toxisch eiwit te coderen.
Naadloos kloneren
Naadloze kloneringstechnologieën elimineren de eis voor restrictie-enzymen. Dit kan een voordeel zijn wanneer een insert een aantal restrictieplaatsen in de sequentie bevat, waardoor het moeilijk is restrictie-enzymen te vinden die het gen tijdens de kloneringsprocedure niet zullen doorsnijden. Naadloos klonen maakt gebruik van homologe recombinatie en er zijn talrijke variaties op deze techniek. In het algemeen bestaat de procedure uit het toevoegen van flanking-sequenties van ongeveer 15 bp lengte aan zowel de insert als de vector via PCR. Exonucleasen worden gebruikt om de insert- en vectorsequenties terug te kauwen en het DNA wordt samengevoegd met behulp van recombinase-enzymen of DNA-ligase. Naadloos klonen is vereenvoudigd door de ontwikkeling van kits die reeds de doelvector bevatten en een eigen mix van enzymen die nodig zijn voor de recombinatiereactie. Met de GenBuilder™ Kit van GenScript kunnen bijvoorbeeld inserts tot 10 kb in 30 minuten worden gekloond en deze kit kan ook worden gebruikt voor high-throughput kloneringsprojecten.
