Oplossing structuur, glycaan specificiteit en fenoloxidase remmende activiteit van Anopheles C-type lectines CTL4 en CTLMA2

Conservatie van CTL4/CTLMA2 in Anopheles

CTL4 en CTLMA2 bestaan beide uit een signaalpeptide, een korte N-terminale sequentie die het CXCXC motief bevat, en een enkel CTL domein. Een recent rapport suggereerde dat de functie van CTL4 en CTLMA2 of hun cofactoren gedivergeerd zijn binnen Anopheles, en meer bepaald dat An. albimanus CTL4 niet de N-terminale cysteïneresiduen bevat die betrokken zijn bij disulfideverbindingen22. We onderzochten eerst opnieuw de orthologs van CTL4 (AGAP005335) en CTLMA2 (AGAP005334), die een nauwe rug-aan-rug oriëntatie hebben op chromosoom 2L (Fig. 1a), met behulp van de huidige genmodellen (vanaf februari 2019) in Vectorbase24. We vonden eiwitten met een N-terminaal CXCXC motief voor 15/16 CTL4 orthologs, waaronder An. albimanus AALB014534, en 13/14 CTLMA2 orthologs. We voerden meervoudige sequentievergelijkingen uit van zowel CTL4 als CTLMA2 van 10 Aziatische, Afrikaanse en Nieuwe Wereld Anopheles soorten (Fig. 1b). De onbewortelde fylogenetische bomen hebben een vrijwel identieke topologie, en een gecombineerde fylogenetische boom heeft twee symmetrische takken, met uitzondering van de positie van An. dirus ten opzichte van An. funestus en An. maculatus.

Dit ondersteunt de hypothese dat CTL4 en CTLMA2 binnen het Anopheles-geslacht geconserveerd zijn, waarbij ontbrekende orthologs wijzen op een onvolledige annotatie van bepaalde genomen. Wij onderzochten de genomische regio van drie soorten met een gerapporteerd CTL4 ortholoog maar geen CTLMA2 ortholoog: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, en An. melas AMEC014491. Alle bezitten een nauw of overlappend gen in omgekeerde oriëntatie – ASTE002636, AMIN007379 en AMEC088499, dat twee CTL-domeinen omvat. Bij An. stephensi en An. minimus wordt het tweede CTL voorafgegaan door een CXCXC-motief, wat suggereert dat het om CTLMA2-orthologs zou kunnen gaan. Bij Aedes- en Culexmuggen is de situatie minder duidelijk. Een CTLMA2-ortholoog met een N-terminaal CXCXC-motief is geannoteerd in Ae. albopictus, AALF001196, en heeft een nauw back-to-back inverted two-exon gen AALF001195, bestaande uit een serine protease en een CTL-domein. Het genmodel van oktober 2018 voor Ae. aegypti omvat een CTLMA2-ortholoog met N-terminaal CXCXC-motief, CTLMA14 (AAEL014382), momenteel vermeld als een CTL4-ortholoog). Een CTLMA2-ortholoog is geannoteerd in C. quinquefasciatus, CPIJ000443, maar mist het N-terminale CXCXC-motief. Dit suggereert dat CTLMA2 is ontstaan in een gemeenschappelijke voorouder van Anopheles en Aedes, terwijl CTL4 wellicht Anopheles-specifiek is.

Biochemische karakterisering

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 en CTLMA2 CRDs (Fig. S1a), en An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) werden tot expressie gebracht in insectencellen met behulp van het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) en gezuiverd tot homogene massa. Volwassen AgCTL4 (25-177) heeft een molaire massa van 17,3 kDa en pI 7,7. Rijpe AgCTLMA2 (18-174) heeft een molaire massa van 17,9 kDa en pI 4,5. De gezuiverde heterodimer heeft een molecuulgewicht op niet-reducerende (NR) SDS-PAGE van 35 kDa (Fig. 2a) en elueert als een enkele piek op grootte-exclusie chromatografie (SEC) met een schijnbare molecuulgewicht van 40 kDa (Fig. 2b). Monomere CTL4 en CTLMA2 verschijnen op reducerende SDS-PAGE bij 17 kDa en 20 kDa, respectievelijk. Zoals eerder is opgemerkt, kan het verhoogde schijnbare molecuulgewicht van CTLMA2 een weerspiegeling zijn van de ongebruikelijke (zure) aminozuurverdeling20.

Het is aangetoond dat An. gambiae CTL4/CTLMA2 wordt gestabiliseerd door een intermoleculaire disulfide tussen cysteïnen van het N-terminale CXCXC-motief; mutatie van deze drie cysteïnen in alanine verhindert de vorming van disulfide tussen de ketens20. Om de plaats van de interketen disulfide verder te verfijnen, construeerden wij negen mutanten die een enkele cysteïne bevatten in het N-terminale CXCXC motief van CTL4 en CTLMA2, brachten de eiwitten tot coëxpressie in Sf9 cellen, en voerden Western Blotting uit om CTL4 en CTLMA2 te detecteren. Intermoleculaire disulfide vorming was inefficiënt, maar duidelijk op niet-reducerend SDS-PAGE in alle gevallen (Fig. 2c).

Dit suggereert dat N-terminale intermoleculaire disulfide vorming tussen CTL4 en CTLMA2 promiscue is, in plaats van dat er een specifiek cysteine residu van elk eiwit bij betrokken is. Als intermoleculaire disulfidevorming promiscue is, zouden CTL4/CTLMA2 heterodimeren in principe multivalente disulfide-gebrugde oligomeren kunnen vormen. Er zijn echter geen disulfide-gebonden oligomeren gedetecteerd op NR-SDS-PAGE voor An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Fig. 2a). Evenzo, terwijl CTL4 en CTLMA2 disulfide-gebonden homodimeren kunnen vormen in vitro20, is het gezuiverde product overweldigend (>95%) heterodimer. Enkele kleine banden (~10%) worden waargenomen op NR-SDS-PAGE voor An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) die homodimeer of oligomeervorming kunnen vertegenwoordigen.

Zowel An. gambiae CTL4/CTLMA2 als An. albimanus CTL4/CTLMA2 zijn polydisperse in oplossing. Hogere-orde niet-covalente oligomerisatie is duidelijk als een schouder van de hoofdpiek in SEC met toenemende concentratie, en is meer uitgesproken voor An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Wij bevestigden het bestaan van oligomere soorten door analytische ultracentrifugatie met sedimentatiesnelheid (AUC) (Fig. 2d). Bij pH 7,5 wordt een reeks van soorten met afnemende intensiteit waargenomen in de c(s)-verdeling: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomerisatie is onafhankelijk van Ca2+ voor A. gambiae CTL4/CTLMA2 maar neemt aanzienlijk toe met Ca2+ voor A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), en is niet gecorreleerd met pH volgens dynamische lichtverstrooiing (DLS) (Fig. 2e).

Calciumbinding

Als CTL’s kunnen zowel CTL4 als CTLMA2 calcium binden. Echter, de canonieke Ca2+ bindende residuen in CTL4 zijn gemuteerd, wat suggereert dat het een CTLD kan zijn, maar geen C-type CRD. Daarom hebben we de calciumbindingsaffiniteit van An. gambiae CTL4, CTLMA2 en het CTL4/CTLMA2 heterodimeer van An. gambiae en An. albimanus gemeten met isothermische titratie calorimetrie (ITC). Onder gelijke condities werd binding waargenomen voor CTLMA2 en CTL4/CTLMA2, maar niet voor CTL4 (Fig. 3a-c). Bindingsconstanten en thermodynamische parameters werden berekend uit de resultaten van drie onafhankelijke experimenten (Tabel 1). De CTLMA2 Ca2+ binding past goed in een single site model met KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. De affiniteit van An. gambiae CTL4/CTLMA2 voor calcium is ~40 × hoger dan CTLMA2 met KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) heeft een vergelijkbare affiniteit voor calcium met KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. De calciumbinding aan zowel An. gambiae als An. albimanus CTL4/CTLMA2 was echter sub-stoichiometrisch (N = 0,36-0,50).

Glycaanbinding

CTL4 en CTLMA2 behoren tot de lijn van myeloïde CTL’s – met inbegrip van macrofaag mannose receptor (MMR) en DC-SIGN – die een geconserveerde familie van immuunreceptoren vormen in metazoötische organismen15,25. Van de CTL’s waarvan de structuur bekend is, heeft CTLMA2 30% sequentie-identiteit met het koolhydraatherkenningsdomein (CRD) van de scavenger receptor van de muis (SCRL, PDB ID 2OX9)26 en het surfactant protein D van de varkens (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 behoudt residuen die geassocieerd zijn met Ca2+ binding in de glycaanbindingslus, en het canonieke EPN motief dat geassocieerd is met D-mannose selectiviteit (Fig. 4a). CTL4 daarentegen mist alle residuen die geassocieerd zijn met Ca2+ binding, wat consistent is met het feit dat er geen binding werd waargenomen door ITC. Het enige bekende CTL met een structuur die sterk lijkt op CTL4 is factor IX/X bindend eiwit (X-bp) uit het gif van de Chinese moccasine Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp is een gemodificeerd CTLD waarin het glycaanbindende domein is vervangen door een lange lus die dimerisatie bemiddelt om de factor IX/X-bindingsplaats te genereren. Hoewel sommige CTL’s van insecten dus geen calcium nodig hebben voor glycaanbinding, is het onduidelijk of CTL4 überhaupt glycanen zou moeten binden.

Om hun lectineactiviteit te bepalen, hebben wij CTL4, CTLMA2 en het CTL4/CTLMA2 heterodimeer geanalyseerd op glycaanarrays die 367 unieke glycaanstructuren vertonen28. Deze studies toonden binding aan een reeks van glycanen aan (Tabel 2). De monomeren van CTL4 en CTLMA2 bonden respectievelijk aan slechts vier en zes glycanen, terwijl het heterodimeer aan 18 verschillende glycanen bond. Er is een aanzienlijk verschil tussen de liganden die door de afzonderlijke monomeren en het heterodimeer worden gebonden; 3/4 (75%) van de door CTL4 herkende glycanen en 2/6 (33%) van de door CTLMA2 herkende glycanen werden niet door CTL4/CTLMA2 herkend.

Teneinde de glycan array resultaten te bevestigen en de bindingsvoorkeuren voor de CTL’s te bepalen, werd SPR analyse uitgevoerd (Tabel 3). Bij bijna alle interacties waren de glycan array en SPR het eens over de aanwezigheid van interacties, waarbij de SPR aangaf dat de glycan array vier fout-negatieve resultaten had: CTLMA2 monomeer met H-antigeen, chondroïtinesulfaat en chondroïtine-6-sulfaat, en CTL4 monomeer met chondroïtine-6-sulfaat. Alle fout-negatieve resultaten vertoonden echter binding op de array met het CTL4/CTLMA2 heterodimeer.

De CTL’s herkenden geen mannose-bevattende glycanen, met uitzondering van mannose-6-fosfaat door CTL4/CTLMA2, ondanks het canonieke EPN-motief dat in CTLMA2 aanwezig is. De herkende structuren zijn in het algemeen glycosaminoglycaan (GAG)-motieven met β1-3/β1-4 bindingen tussen glucose (Glc), galactose (Gal) en hun respectieve hexosaminen GlcNac en GalNac. De Galβ1-4Glc koppeling was aanwezig in 12/23 (52%) van de herkende glycanen, waaronder 6/23 (26%) die Galβ1-4GlcNac bevatten en 4/23 (17%) die het keratan motief Galβ1-4GlcNac β1-3Gal of GlcNac β1-3Galβ1-4Glc bevatten.

De array vertoonde ook enige voorkeur voor polymerische en gesulfateerde glycanen. Van de vier glycanen die door CTL4 werden herkend, was de sterkste hit voor globopentaose (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 bond ook HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n en β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Drie van de vijf glycanen die door het CTLMA2-monomeer werden herkend waren gesulfateerd, en het CTL4/CTLMA2-heterodimeer herkende chondroïtinesulfaat en chondroïtine-6-sulfaat, hyaluronzuur (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8, en HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Deze resultaten suggereren dat er verschillende en synergistische effecten zijn van heterodimerisatie op glycaanbinding.

Zowel CTLMA2 als het CTL4/CTLMA2 heterodimer herkent verschillende fucose-bevattende suikers, waaronder sialyl-LewisX en sulfo-LewisA maar niet sialyl-LewisA. De hoogste affiniteit werd waargenomen voor sulfo-LewisA met binding aan het CTLMA2 (106 nM) en CTL4/CTLMA2 (95 nM) complex bij een KD van ~100 nM (tabel 3). De hoogste affiniteitsbinding die voor CTL4 werd waargenomen was ook aan een gesulfateerd glycan, sulfo-lactosamine (292 nM).

Structurele analyse

Om de structuur van CTL4 en CTLMA2 verder te onderzoeken, genereerden wij structurele modellen van CTL4 en CTLMA2 (Fig. 4b) met behulp van MODELLER29 met extra handmatige bewerking. Zowel CTL4 als CTLMA2 hebben een verlengde lus (lus 1) die de tweede helix van de CTLD volgt (Fig. 4a) met een hoge dichtheid aan complementair geladen residuen; basische residuen voor CTL4 en zure residuen voor CTLMA2. De complementaire elektrostatica van deze lus 1 residuen en hun nabijheid tot het N-terminale CXCXC motief suggereren dat dit een potentieel eiwit/eiwit raakvlak is binnen het heterodimeer (Fig. 4b), waarvoor een hypothetisch model werd gegenereerd met een enkele disulfide binding in het CXCXC motief. De glycaan/Ca2+ bindingslussen vormen echter een tweede potentiële interface, zoals waargenomen voor de twee ketens van D. acutus X-bp. De alternatieve hypothese is dat de twee CTL-domeinen onafhankelijk van elkaar zijn, met flexibele linkers die hen verbinden via de intermoleculaire hypothese.

Om deze hypothese te testen, analyseerden wij de oplossingsstructuur van CTL4/CTLMA2 door kleine hoek röntgenverstrooiing (SAXS). Experimenten werden uitgevoerd in 0.5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9.0, 0.5 mM CaCl2, en 1% glycerol om interacties tussen de deeltjes te minimaliseren. In deze omstandigheden vertoonde het eiwit een lineair verband tussen geëxtrapoleerde intensiteit bij nulhoek en concentratie (I0 vs. c) tot een concentratie van 3,1 mg/ml. De buffer-geëxtrapoleerde curve van intensiteit I vs q (Fig. 4c) werd onderworpen aan SAXSMoW2 die RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) en molecuulgewicht MW = 39 kDa, slechts 11% groter dan de verwachte heterodimer MW van 35 kDa30 oplevert. De berekende Guinier-plot is echter gebaseerd op slechts zeven datapunten; passen over een groter bereik (Fig. 4c, inzet) levert RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), terwijl passen van de paarsgewijze verdelingsfunctie P(r) (Fig. 4d) een RG = 25,4 Å (I0 = 0,65) oplevert. De P(r)-verdeling past DAMMIF31 met 20 ab initio korrelmodellen met een gemiddelde genormaliseerde structurele discrepantie NSD = 1,0 ± 0,2. De hoofdmassa van de ab initio modellen is qua vorm vergelijkbaar met de verwachte CTL4/CTLMA2 heterodimer.

Extra dichtheid strekt zich uit van de hoofdmassa van de kraalmodellen die ofwel de N-terminale sequentie van beide eiwitten inclusief het CXCXC motief kan weerspiegelen, ofwel een minder belangrijke populatie van CTL4/CTLMA2 met een hogere radius gyratie. Om deze hypothese te testen hebben wij multi-state modellering van het SAXS profiel uitgevoerd met het programma MULTIFOXS32. Wij genereerden een compleet model voor CTL4-6xHis/CTLMA2 met een N-terminale coiled-coil die wordt afgesloten door een intermoleculaire disulfide tussen CTL4 C39 en CTLMA2 C34. MULTIFOXS genereerde een ensemble van 10.000 varianten van het model om te vergelijken met de experimentele verstrooiingscurve. De enige flexibele residuen waren CTL4 40-45 en 178-183 (6xHis) en CTLMA2 35-39, met een N-terminale spiraal die dient als een star lichaam dat de twee ketens verbindt. Het beste één-staat-model paste bij de gegevens met χ2 = 1,13 en had RG = 23,7 Å. De minimale χ2 = 1,07 werd bereikt met een drie-staten-model (Fig. 4e), waarin 80% van de verstrooiing wordt bijgedragen door twee compacte modellen met RG = 22,0 Å en RG = 23,7 Å. Deze gegevens zijn consistent met de vorming van een compact heterodimeer tussen CTL4 en CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 remmen de activering van fenoloxidase als reactie op E. coli

CTL4 en CTLMA2 functioneren als remmers van de melanisatierespons van muggen op infectie. Eerder werd gerapporteerd dat CTL4 knockdown niet leidde tot verhoogde fenoloxidase (PO) activiteit als reactie op infectie met een mengsel van E. coli en S. aureus20. Dezelfde studie vond echter dat dsCTL4 en dsCTLMA2 muggen specifiek vatbaar waren voor Gram-negatieve bacteriën. Daarom onderzochten we opnieuw het effect van CTL4 en CTLMA2 knockdown op hemolymfe PO activiteit in reactie op alleen E. coli infectie (Fig. 5a). Na 4 uur infectie met E. coli was de PO activiteit significant verhoogd voor dsCTL4 (p = 0.02) en dsCTLMA2 (p = 0.004) muggen in vergelijking met dsLacZ controles (Fig. 5b). De gemiddelde knockdown efficiëntie voor CTL4 en CTLMA2 was 93 ± 3% en 89 ± 3%, respectievelijk, met >80% in een enkel experiment.

Melanisatie van Plasmodium ookinetes na silencing door CTL4/CTLMA2 is afhankelijk van LRIM117,22, TEP133 en SPCLIP133. Aangezien dit allemaal elementen zijn van de TEP1 complement-achtige immuunrespons, redeneerden wij dat verhoogde PO activiteit in afwezigheid van CTL4 TEP1-afhankelijk zou moeten zijn. Dienovereenkomstig vergeleken we de verhoging van PO activiteit in dsCTL4 muggen met gelijktijdige toediening van dsTEP1 met gelijktijdige toediening van dsLacZ (Fig. 5c). De gemiddelde knockdown efficiëntie voor TEP1 was 82 ± 9% en >80% in 5/6 experimenten (64% in een experiment). Er was inderdaad geen significante verhoging van de PO activiteit in dsCTL4 muggen wanneer TEP1 ook was uitgeschakeld. Dit bevestigt dat melanisatie in afwezigheid van CTL4/CTLMA2 TEP1-afhankelijk is.

Toediening van recombinant CTL4/CTLMA2 met E. coli keerde de verhoging van PO activiteit in dsCTL4 muggen significant om in vergelijking met BSA (p = 0.007, Fig. 5d). Deze resultaten tonen aan dat CTL4/CTLMA2 direct betrokken is als een negatieve regulator van PO activiteit. In dsLacZ muggen echter onderdrukte CTL4/CTLMA2 de door E. coli geïnduceerde PO activiteit niet in vergelijking met boviene serum albumine (BSA). Ook was de E. coli-geïnduceerde PO activiteit in dsCTL4 muggen geïnjecteerd met recombinant CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTLs) hoger dan die van dsLacZ muggen geïnjecteerd met BSA (dsLacZ + BSA). Vandaar dat het injecteren van recombinant CTL4/CTLMA2 het verlies van endogeen eiwit niet volledig red.