Lysozym was het eerste enzym waarvan de röntgenstructuur met hoge resolutie werd bepaald. Dit werd in 1965 bereikt door David Phillips, werkzaam bij het Royal Institution in Londen. Phillips stelde vervolgens een mechanisme voor de werking van lysozym voor dat hoofdzakelijk gebaseerd was op structurele gegevens. Het mechanisme van Phillips is sindsdien door experimenteel bewijsmateriaal bevestigd, zoals wij later zullen zien.
Lysozym wordt veel aangetroffen in de cellen en secreties (met inbegrip van tranen en speeksel) van gewervelde dieren, en het eiwit van kippeneieren is bijzonder rijk aan dit enzym. Lysozym katalyseert de hydrolyse van glycosidebindingen die N-acetylmuraminezuur (NAM) en N-acetylglucosamine (NAG) verbinden in polysacchariden van bacteriële celwanden. Daardoor beschadigt het de integriteit van de celwand en werkt het als een bacteriedodend middel. De NAM-NAG binding is weergegeven in figuur 40, met de plaats van splitsing door lysozym aangegeven.
Lysozym is een betrekkelijk klein enzym. Kippenei-eiwitlysozym bestaat uit een enkel polypeptide van 129 aminozuren lang (figuur 41) met Mr 14 600. Uit röntgendiffractiegegevens blijkt dat er een duidelijke kloof in de lysozymstructuur is (figuur 42). De actieve plaats bevindt zich in deze spleet. In de aminozuursequentie in figuur 41 en in het ruimtevullende model van lysozym in figuur 42 zijn de residuen die de substraatbindingszak in het gevouwen eiwit begrenzen, gemarkeerd.
De actieve plaats van lysozym is een lange groef die plaats biedt aan zes suikers van de polysaccharideketen tegelijk. Wanneer het enzym de polysaccharide bindt, hydrolyseert het een van de glycosidebindingen. Als de zes suikers in het stuk polysaccharide worden geïdentificeerd als A-F, ligt de splitsingsplaats tussen D en E, zoals aangegeven in figuur 40. De twee polysaccharidefragmenten komen dan vrij. Figuur 43 geeft de fasen van deze reactie weer, die hieronder ook in detail worden beschreven.
-
Bij binding aan het enzym neemt het substraat een gespannen conformatie aan. Residu D wordt vervormd (niet weergegeven in het diagram) om plaats te bieden aan een -CH2OH-groep die anders een ongunstig contact met het enzym zou maken. Op deze manier dwingt het enzym het substraat een conformatie aan te nemen die de conformatie van de overgangstoestand benadert.
-
Residu 35 van het enzym is glutaminezuur (Glu 35) met een proton dat het gemakkelijk naar het polaire O-atoom van de glycosidebinding overbrengt. Op deze manier wordt de C-O-binding in het substraat gesplitst (Figuur 43a en b).
-
Residu D van het polysaccharide heeft nu een netto positieve lading; dit reactie-intermediair staat bekend als een oxoniumion (Figuur 43b). Het enzym stabiliseert dit tussenproduct op twee manieren. Ten eerste reageert een nabijgelegen aspartaatresidu (Asp 52), dat zich in de negatief geladen carboxylaatvorm bevindt, met de positieve lading van het oxoniumion. Ten tweede maakt de vervorming van residu D het mogelijk de positieve lading te delen tussen zijn C- en O-atoom. (Merk op dat dit delen van lading tussen atomen resonantie wordt genoemd, op dezelfde manier als het delen van elektronen tussen de atomen van de peptidegroep). Het tussenproduct oxoniumion is dus de overgangstoestand. Normaal zou een dergelijk tussenproduct zeer onstabiel en reactief zijn. Asp 52 helpt het oxoniumion te stabiliseren, maar reageert er niet mee. Dit komt doordat de reactieve groepen op een afstand van 3 Å te ver uit elkaar liggen.
-
Het enzym laat nu residu E met het aangehechte polysaccharide los, waardoor een glycosyl-enzyme-tussenproduct ontstaat. Het oxoniumion reageert met een watermolecuul uit het oplosmiddelmilieu, waarbij een hydroxylgroep wordt geëxtraheerd en Glu 35 wordt gere-protoneerd (figuur 43c en d).
-
Het enzym laat nu residu D met het aangehechte polysaccharide vrij en de reactie is voltooid.
-
Het katalytische mechanisme van lysozym omvat zowel algemene zuur- als algemene basekatalyse. Welke residuen nemen hieraan deel?
-
Glu 35 neemt deel aan de algemene zuurkatalyse (doneert een proton) en Asp 52 neemt deel aan de algemene basekatalyse (stabiliseert de positieve lading van het oxoniumion).
Het hierboven geschetste Phillips-mechanisme voor de katalyse van lysozym wordt ondersteund door een aantal experimentele waarnemingen. Met name het belang van Glu 35 en Asp 52 in het proces is bevestigd door site-directed mutagenesis (SDM) experimenten. SDM is een zeer krachtige techniek om de rol van afzonderlijke aminozuurresiduen in de functie van een eiwit te onderzoeken en zal in punt 7.2 uitvoerig worden besproken. SDM behelst het gebruik van recombinant-DNA-technologie om selectief het residu van interesse te vervangen door een ander aminozuur met kritisch verschillende eigenschappen. Het resulterende eiwit kan dan functioneel worden getest, b.v. met betrekking tot substraatbinding of katalytische activiteit. Toen deze techniek werd toegepast op lysozym om Glu 35 te vervangen door een glutamine residu (Gln), kon het resulterende eiwit nog steeds het substraat binden (zij het minder sterk), maar het had geen katalytische activiteit. Glu 35 is dus essentieel voor de katalytische activiteit van lysozym. Wanneer Asp 52 werd vervangen door een asparagine (Asn) residu, had het gemuteerde eiwit minder dan 5% van de katalytische activiteit van normaal (wild-type) lysozym, ondanks het feit dat de gemuteerde vorm in feite een twee maal hogere affiniteit had voor het substraat. Hieruit volgt dat Asp 52 essentieel is voor de katalytische activiteit van lysozym. Experimenten met chemische middelen die deze residuen covalent veranderden, zonder de röntgenstructuur significant te beïnvloeden, toonden eveneens aan dat zij essentieel zijn voor de katalytische activiteit.