Relationship between the Size of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Reservoir in Peripheral Blood CD4+ T Cells and CD4+:CD8+ T Cell Ratios in Aviremic HIV-1-Infected Individuals Receiving Long-Term Highly Active Antiretroviral Therapy

Abstract

Het is aangetoond dat de replicatie van humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) aanhoudt bij de meeste geïnfecteerde personen die hoog actieve antiretrovirale therapie (HAART) krijgen. Studies die de relatie tussen lage niveaus van voortdurende virale replicatie en immunologische parameters, zoals de CD4+:CD8+ T cel ratio, bij zulke individuen hebben onderzocht, zijn echter uitgebleven. Hier wordt een statistisch significante inverse correlatie aangetoond tussen de frequentie van CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA en de CD4+:CD8+ T-cel ratio bij geïnfecteerde personen die HAART kregen en bij wie de plasma viremie gedurende langere perioden tot onder de detectiegrens was onderdrukt. Er werd geen correlatie gevonden tussen de frequentie van HIV-1-specifieke cytotoxische CD8+ T-lymfocyten (CTL’s) en de CD4+ :CD8+ T-celratio’s bij deze personen. Deze gegevens suggereren dat persistente virale replicatie op laag niveau, hoewel niet voldoende om HIV-1-specifieke CTL-responsen in stand te houden, gedeeltelijk kan verklaren waarom de CD4+ :CD8+ T-celratio niet wordt genormaliseerd bij sommige geïnfecteerde personen die met succes met HAART worden behandeld.

Het gebruik van hoog-actieve antiretrovirale therapie (HAART) bij de behandeling van met het humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) geïnfecteerde personen heeft het klinische resultaat voor veel geïnfecteerde personen drastisch veranderd en heeft geleid tot een aanzienlijke daling van de incidentie van AIDS en van het sterftecijfer. De aanwezigheid van replicatiecompetent virus, HIV-1 proviraal DNA (waaronder 2 long terminal repeat cirkels), gesplitst en niet-gesplitst HIV-1 RNA in CD4+ T-cellen, en niet-geïdentificeerde virusreservoirs is echter aangetoond bij de meeste geïnfecteerde personen bij wie de plasmaviremie tot onder de detectiegrens is gedaald, en deze bronnen van voortdurende replicatie zijn naar voren gekomen als het belangrijkste obstakel bij het verhinderen van de uitroeiing van HIV-1.

Na de start van HAART daalt de plasmaviremie snel tot onder de detectiegrens bij een groot deel van de geïnfecteerde personen en wordt gevolgd door een geleidelijke toename van het aantal CD4+ en afname van het aantal CD8+ T-cellen. Normalisatie van de CD4+:CD8+ T-celratio’s wordt echter niet bereikt bij sommige geïnfecteerde personen die anders met succes op HAART hebben gereageerd. In dit verband is gesuggereerd dat de chronisch verhoogde niveaus van CD8+ T-cellen of abnormale CD4+:CD8+ T-celverhoudingen in het perifere bloed worden aangedreven door actieve virale replicatie bij geïnfecteerde personen die onbehandeld zijn of een suboptimale antivirale therapie krijgen. Bovendien is aangetoond dat de expressie van de activeringsmarker CD38 op CD8+ T-cellen een prognostische marker voor ziekteprogressie is. Hoewel is gesuggereerd dat het niet normaliseren van de CD4+:CD8+ T-celverhouding bij sommige patiënten die HAART krijgen wordt toegeschreven aan onvolledige onderdrukking van virale replicatie , zijn er geen gerapporteerde gegevens die deze vraag rechtstreeks beantwoorden, vooral bij patiënten die langdurig HAART hebben gekregen en bij wie de plasmaviremie goed is onderdrukt.

Het is vastgesteld dat het reservoir van geïnfecteerde CD4+ T-cellen in het perifere bloed, zoals bepaald door het aantal cellen dat HIV-1 proviraal DNA draagt, in stand wordt gehouden door voortdurende virale replicatie, zelfs op zeer lage niveaus . In de huidige studie evalueerden wij de relatie tussen de verhoudingen van CD4+:CD8+ T-celtellingen en de frequentie van CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA in gezuiverde CD4+ T-cellen, evenals de frequentie van HIV-specifieke cytotoxische CD8+ T-lymfocyten (CTL’s) bij geïnfecteerde personen die langdurig HAART hebben gekregen en bij wie de plasmaviremie is onderdrukt tot onder het detectieniveau, zoals bepaald door standaardtests.

Patiënten en Methoden

Isolatie van CD4+ T-cellen. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden verkregen door ficoll-hypaque dichtheidsgradiëntcentrifugatie. CD4+ T-cellen werden geïsoleerd uit PBMC van HIV-1-geïnfecteerde personen, met behulp van een kolom-gebaseerde celscheidingstechniek (Stem-Cell Technologies), zoals elders beschreven.

Quantitatieve real-time HIV-1 DNA PCR. Om de frequentie te bepalen van CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 provirus bij geïnfecteerde personen, werd een real-time PCR uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit 1-2 × 106 gezuiverde CD4+ T-cellen, met behulp van de Puregene DNA-isolatiekit (Gentra), volgens de specificaties van de fabrikant. DNA (1 µg) werd vervolgens gebruikt als sjabloon voor real-time PCR in een iCycler (Bio-Rad). De amplificatiereactie werd in drievoud uitgevoerd met 0,5 µM primers, 0,2 µM fluorescerende probe, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2, en 2,5 U Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) in een totaal volume van 50 mL. De primers 5′- GGTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ primer) en 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ primer) werden gebruikt samen met de fluorescerende probe 5′-6FAM-AGTAGTGTGCCCGTCTGTTTAMRA- 3′. De PCR-condities bestonden uit een denaturatiestap bij 95°C gedurende 3 min, gevolgd door 45 cycli van 15 s bij 95°C en 1 min bij 58°C. Serieel verdund ACH-2 DNA werd ook onderworpen aan de bovenstaande PCR om standaardcurves te verkrijgen.

Flow cytometrische analyse van HIV-1-specifieke CD8+ T-cellen. De frequentie van CD8+ T-cellen specifiek voor HIV-1 werd bepaald door analyse van intracellulaire interferon (IFN)-γ-positieve cellen na stimulatie met HIV-1-specifieke peptiden (20 mer overlappende 15 aa). Pools van overlappende peptiden (1 µg elk; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) verspreid over de gehele HIV-1 gag, pol, env, en nef sequenties werden in eerste instantie geïncubeerd met 3 × 106 PBMC gedurende 10 min in een ronde-bottom 5-mL buis (Becton Dickinson) in 0,1 mL van compleet medium in een 37 ° C CO2 incubator. Vervolgens werd 0,4 ml compleet medium aan het buisje toegevoegd en na een incubatie van 2 uur werd Brefeldin A (Sigma) aan het medium toegevoegd in een eindconcentratie van 10 mg/ml om de secretie van IFN-γ te remmen. Na 6 uur incubatie werden de cellen tweemaal gewassen, gefixeerd met 1× fixeeroplossing (Becton Dickinson) gedurende 10 min bij kamertemperatuur, en opnieuw gewassen. De cellen werden permeabiliseerd met 1× permeabilisatieoplossing 2 (Becton Dickinson), en verder gedurende 10 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na opnieuw te zijn gewassen, werden de cellen gekleurd met de volgende antilichamen: fluoresceïne-isothiocyanaat-geconjugeerd anti-CD8, fycoerythrine-geconjugeerd anti-IFN-γ, peridinine-chlorofyl-eiwit-geconjugeerd anti-CD69, en allofycocyanine-geconjugeerd anti-CD3 antilichamen (Becton Dickinson). Met een poort op CD3 + CD8 + lymfocyten, ~ 100.000 gebeurtenissen werden verzameld, met behulp van een FACSCalibur (Becton Dickinson), en de frequentie van IFN-γ + CD69 + cellen werd bepaald door het gebruik van Cellquest software (Becton Dickinson).

Statistische analyse. Spearman’s rangcorrelatie werd gebruikt als maat voor de correlatie tussen (1) de frequentie van CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA en CD4+ en CD8+ T-celtellingen en de CD4+:CD8+ T-cel ratio en (2) de frequentie van HIV-1-specifieke CTL’s en CD4+ en CD8+ T-celtellingen, de CD4+:CD8+ T-cel ratio, en de aantallen CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA. Fisher’s exact test werd gebruikt om de associatie van CD4+:CD8+ T cel ratio’s ⩾1.0 of <1.0 met provirale belasting in het CD4+ T cel compartiment te bepalen. De Bonferroni-methode voor de aanpassing van P-waarden voor meervoudige toetsing werd toegepast op de correlaties van CD4+ en CD8+ T celtellingen en CD4+:CD8+ T cel ratio met de frequentie van CD4+ T cellen die HIV-1 proviraal DNA dragen, en werd toegepast op de correlaties van CD4+ en CD8+ T celtellingen, CD4+:CD8+ T cel ratio, en de niveaus van proviraal HIV-1 DNA in het CD4+ T cel compartiment met de frequentie van HIV-1-specifieke CTLs.

Resultaten

Correlatie tussen de grootte van het CD4+ T-celreservoir van HIV-1 en immunologische parameters. Om de relatie te onderzoeken tussen de grootte van het perifere bloed CD4+ T cel reservoir voor HIV-1 en abnormale perifere immunologische parameters bij geïnfecteerde personen die gedurende langere perioden succesvolle HAART kregen, probeerden wij correlaties vast te stellen tussen de frequentie van CD4+ T cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA en de CD4+ en CD8+ T cel aantallen en CD4+ :CD8+ T cel ratio. Er was een statistisch significante inverse correlatie tussen de frequentie van CD4 + T-cellen met HIV-1 proviraal DNA en de CD4 + T-cel aantallen in het perifere bloed van de geïnfecteerde personen die we bestudeerden (P = .02; figuur 1A). In tegenstelling hiermee werd er geen correlatie gevonden tussen de HIV-1 proviraal DNA belasting in CD4+ T cellen en de CD8+ T cel aantallen (P = .34; figuur 1B). Wanneer deze 2 immunologische parameters werden gecombineerd en uitgedrukt als CD4+:CD8+ T cel ratio, werd een sterke inverse correlatie waargenomen tussen deze waarden en de frequentie van CD4+ T cellen die drager waren van HIV-1 proviraal DNA (P .01; figuur 1C). Bovendien hadden 14 (74%) van de 19 patiënten met CD4+:CD8+ T-cel ratio’s ,1.0 een HIV-1 DNA provirale lading van <1000 kopieën/µg genomisch DNA afkomstig van CD4+ T-cellen. Daarentegen hadden 10 (77%) van 13 patiënten met CD4+:CD8+ T-cel ratio’s >1.0 HIV DNA provirale ladingen van ,1000 kopieën/mg van genomisch DNA afkomstig van CD4+ T-cellen (P = .01; figuur 1C).

Correlatie tussen de frequentie van HIV-1-specifieke CTL’s en immunologische en virologische parameters. Er is aangetoond dat de frequentie van HIV-1-specifieke CTL’s geleidelijk afneemt na de start van HAART bij HIV-1-geïnfecteerde personen als gevolg van de afnemende beschikbaarheid van HIV-1-antigenen . Wij onderzochten de relatie tussen de frequentie van HIV-1-specifieke CTL’s en CD4+:CD8+ T cel ratio’s bij geïnfecteerde personen die gedurende langere periodes succesvol op HAART hadden gereageerd. Er werd geen statistisch significante correlatie gevonden tussen de frequenties van CTLs die reageerden op HIV-specifieke peptiden afgeleid van gag, pol, env, en nef genen en CD4+:CD8+ T cel ratio’s (figuur 2). Bovendien werd er geen statistisch significante correlatie gevonden tussen het aantal HIV-1-specifieke CTL’s en CD4+ en CD8+ T-celtellingen en het aantal CD4+ T-cellen die HIV-1 proviraal DNA dragen (data niet weergegeven). Er was een trend naar hogere aantallen CTL’s bij individuen met lagere CD4+:CD8+ T cel ratio’s.

Discussies

Het wijdverbreide gebruik van HAART bij de behandeling van HIV-1 ziekte heeft geleid tot een dramatische verbetering van het klinische resultaat. Hoewel plasmaviremie onder de detectiegrens kan worden gehouden bij veel geïnfecteerde personen die HAART krijgen, vormt de persistentie van lage niveaus van voortdurende virale replicatie in CD4+ T-cellen een belangrijk obstakel bij het bereiken van eradicatie van HIV-1 . Aanhoudend lage niveaus van virale replicatie worden immers beschouwd als de belangrijkste factor bij het in stand houden van het HIV-1-reservoir, zoals blijkt uit de frequentie van CD4+ T-cellen die HIV-1-proviraal DNA dragen bij patiënten wier plasmaviremie door HAART is onderdrukt tot onder het detectieniveau van standaardtests. Bovendien zijn de aanhoudende niveaus van verhoogde CD8+ T-celtellingen waargenomen bij een groot deel van de geïnfecteerde patiënten die HAART krijgen. In dit verband is gesuggereerd dat actieve virale replicatie verantwoordelijk is voor de verhoogde niveaus van CD8 + T-cellen en dat het expressieniveau van de activeringsmarker CD38 op deze cellen is aangetoond als een prognostische marker van ziekteprogressie bij afwezigheid van effectieve antivirale therapie .

Ondanks een gebrek aan gepubliceerde gegevens, is gespeculeerd dat omgekeerde CD4+:CD8+ T cel ratio’s in het perifere bloed van geïnfecteerde personen die succesvol worden behandeld met HAART te wijten zijn aan lage niveaus van voortdurende virale replicatie . In de huidige studie hebben we onderzocht of de omgekeerde CD4+:CD8+ T cel ratio’s bij sommige geïnfecteerde personen die langdurig HAART kregen, te wijten waren aan onvolledige onderdrukking van HIV-1 replicatie, zoals blijkt uit de grootte van het HIV-1 proviraal DNA reservoir in CD4+ T cellen. De aanhoudende aanwezigheid van HIV-1 proviraal DNA in het CD4+ T cel compartiment bij geïnfecteerde patiënten die HAART krijgen is elders overtuigend beschreven en wordt verondersteld een onvolledige remming van residuele virale replicatie weer te geven, ondanks onderdrukking van plasma viremie tot ondetecteerbare niveaus. Wij toonden een sterke omgekeerde correlatie aan tussen de frequentie van geïnfecteerde CD4+ T cellen die HIV-1 proviraal DNA bevatten en CD4+ en CD8+ T cel ratio’s, wat suggereert dat lage niveaus van residuele virale replicatie gedeeltelijk verantwoordelijk kunnen zijn geweest voor de abnormale CD4+:CD8+ T cel ratio’s in het perifere bloed.

Hoewel de frequentie van CD4+ T cellen die proviraal HIV-1 DNA bevatten direct geassocieerd kan zijn met CD4+:CD8+ T cel ratio’s, kunnen andere factoren deze relatie beïnvloeden. Parameters zoals het bestaan van onbekende virusreservoirs die actieve virale replicatie ondersteunen in de aanwezigheid van HAART, abnormaliteiten in het gastheerimmuunsysteem, de werkzaamheid van bepaalde therapeutische regimes, of andere verstorende factoren kunnen een effect hebben op zowel CD4+: CD8+ T-celratio’s en de proviraal DNA-ladingen in het CD4+ T-celcompartiment. Onze gegevens suggereren dat voortdurende virale replicatie op niveaus die niet aantoonbaar zijn met standaardtests voor plasmaviremie, maar die het CD4+ T-celreservoir van HIV-1 in stand houden, weliswaar voldoende is om de normalisatie van de CD4+: CD8+ T cel ratio’s bij de patiënten die in deze studie zijn onderzocht, zijn niet voldoende om HIV-1-specifieke CTL responsen in stand te houden.

Men zou kunnen aanvoeren dat de aanhoudende abnormale CD4+:CD8+ T cel ratio’s bij geïnfecteerde personen die langdurig HAART krijgen ook toegeschreven zouden kunnen worden aan zowel immunologische als virologische factoren. In dit verband is aangetoond dat, bij afwezigheid van ziekteprogressie en voldoende herstel van CD4+ T-cellen, de totale T-celhomeostase bij geïnfecteerde personen wordt gehandhaafd door verhoogde niveaus van CD8+ T-cellen die op hun beurt de regeneratie van CD4+ T-cellen kunnen belemmeren. We hebben echter geen correlatie gevonden tussen het niveau van CD4+ T-cellen die drager zijn van HIV-1 proviraal DNA en het aantal CD8+ T-cellen.

Ten slotte hebben eerdere studies aangetoond dat de aanmaak van CD4+ T-cellen in de thymus ernstig belemmerd wordt door directe of indirecte gevolgen van actieve virale replicatie. In dit verband zijn verminderde niveaus van thymische output, zoals gemeten door de frequentie van naïeve CD4 + T-cellen die T-cel receptor-rearrangement excision cirkels dragen, aangetoond bij geïnfecteerde personen . Hoewel het niet duidelijk is of voorlopers van CD4+ T-cellen door HIV-1 in de thymus worden geïnfecteerd, suggereren onze gegevens sterk dat onvolledige onderdrukking van virale replicatie bij geïnfecteerde personen die HAART krijgen, de infectie in het CD4+ T-celcompartiment in het perifere bloed blijft verspreiden, wat resulteert in de instandhouding van het CD4+ T-celreservoir voor HIV-1.

Acknowledgments

Wij danken Paul Parks voor het inplannen van patiëntenbezoeken, Susan Moir voor het lezen van dit manuscript en voor nuttige discussies, en de patiënten voor hun deelname aan deze studie.

Figures and Tables