Juni 1, 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Founder and Principal Writer DeeAnn Visk Consulting
Gene Therapy Must Breach Cellular Ramparts without Reenacting the Fall of Jericho in Miniature
Immunotherapieën tegen kanker, vaccins tegen nieuwe virussen (of oude virussen op nieuwe plaatsen), en pogingen om pathogene eencellige defecten op te lossen – alle zijn op zoek om transfectietechnologie te incorporeren. Deze technologie, die verschillende manieren omvat om nucleïnezuren in cellen in te brengen, houdt een grote belofte in, maar brengt ook ernstige uitdagingen met zich mee.
Deze uitdagingen zijn het meest prominent geweest bij pogingen om gentherapie in te zetten, waarbij het probleem van moeilijk te transfecteren cellen, organen en hele dieren moeilijk kon worden aangepakt.
Deze transfectie-uitdagingen zijn door verschillende biotechnologiebedrijven aangegaan. Zo bieden MaxCyte, Lonza en Mirus Bio elektroporatie aan als een methode die weinig residu achterlaat. Elektroporatie is echter niet geschikt voor gebruik bij alle dieren, zodat andere methoden nodig zijn. Een alternatieve techniek is virale infectie. Deze wordt toegepast door bedrijven als GenVec.
Een andere uitdaging, die met name relevant is voor virale transfectie, is de mogelijkheid van het stimuleren van een immuunrespons. Dit potentiële negatieve kan echter een echt positief zijn in de juiste context, die toevallig de ontwikkeling van vaccins is. Het gebruik van virale transfectiebenaderingen om vaccinatiemechanismen te versterken is een specialiteit van Thermo Fisher Scientific. Het bedrijf biedt ook traditionele transfectie op chemische basis die werkt in het hele dier.
Tezamen bieden de tot nu toe genoemde bedrijven technologieën die alle belangrijke modi van therapeutisch relevante transfectie bestrijken: transfectie op chemische basis, niet-chemische methoden (hoofdzakelijk elektroporatie) en virale transductie. Ook hybride benaderingen worden ontwikkeld, zoals in de volgende paragrafen duidelijk zal worden.
Elektroporatie
MaxCyte’s elektroporatieplatform is GMP-conform en naadloos schaalbaar van onderzoek tot commerciële schaal. “Met ons flow electroporation systeem kunnen een miljoen tot enkele honderden miljarden cellen worden getransfecteerd in minder dan 30 minuten in een volledig geautomatiseerd gesloten systeem,” legt Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO uit. “Ons systeem is zowel ISO 9000 als FDA-compliant, zodat het gemakkelijk kan voldoen aan de behoeften van productie op therapeutisch niveau.”
“We werken routinematig samen met farmaceutische en biotechbedrijven om ex vivo gemanipuleerde immuun- en stamceltherapieën te ontwikkelen. Soms is het doel om snel vaccins en biologische geneesmiddelen met een hoge opbrengst, zoals antilichamen, te produceren. Andere keren stellen we klanten in staat om grootschalige high-titer productie van virale vectoren te creëren met behulp van suspensie- en adherente cellen. Dit helpt niet alleen bij de therapeutische ontwikkeling, maar kan ook toepassingen voor de ontdekking van geneesmiddelen versnellen.”
Dankzij deze mogelijkheid om cellen in grote of kleine aantallen te verwerken, kunnen wetenschappers op de werkbank een procesprotocol ontwikkelen met gebruikmaking van flowelectroporatie voor kleine celaantallen. Het opschalen van dit proces verloopt dan naadloos zonder de gebruikelijke hoofdbrekens van kwaliteitsbehoud, aangezien het transfectieproces hetzelfde blijft.
“Deze vermindering van het risico is zeer aantrekkelijk voor onze partners. Het waarborgen van consistentie van onderzoek, naar de kliniek, naar commerciële schaal, en van run tot run, van donor tot donor, en van patiënt tot patiënt is van cruciaal belang om therapieën efficiënt door het ontwikkelingsproces te loodsen,” beweert Dr. Peshwa.
Weliswaar werken chemische en lipide benaderingen goed in onderzoek met gevestigde cellijnen, maar er zijn vaak onverwachte gevolgen van het transfecteren van primaire cellen. Bovendien zijn deze traditionele chemische middelen om cellen te transfecteren moeilijk op te schalen naar industriële productie.
Electroporatie, de niet-virale benadering die door MaxCyte wordt gebruikt, maakt het mogelijk de biologie van de getransfecteerde cellen in een meer natuurlijke staat te houden op elke schaal. Door onbedoelde gevolgen tijdens het transfectieproces te voorkomen, kan de technologie van MaxCyte het creëren van wegversperringen vermijden en tegelijkertijd de behoefte aan hoge transfectie-efficiëntie oplossen.
“Deze therapeutische interventies moeten vrijwel gegarandeerd zijn dat ze minimale onbedoelde negatieve gevolgen hebben voor de cellen die worden gemodificeerd – de biologie moet tijdens elke fase van het proces hetzelfde zijn,” benadrukt Dr. Peshwa. “Bovendien kan ons flow electroporation systeem op een geautomatiseerde manier worden gebruikt. Het wordt al routinematig gebruikt in Japan voor commerciële therapeutische behandelingen en is in verschillende stadia van adoptie over de hele wereld.”
Een andere overweging is waar de transfectie plaatsvindt. Worden de bij een patiënt geoogste cellen voor bewerking naar een andere stad vervoerd? Wat gebeurt er als een pakket verloren gaat, of vertraging oploopt, of te maken krijgt met temperatuurschommelingen? Het platform dat MaxCyte biedt, biedt de mogelijkheid om nieuwe therapeutica te ontwikkelen door de cellen van patiënten ter plaatse te verwerken, waarbij de grote logistieke en COGS (cost of goods sold)-problemen van andere methoden worden omzeild.
Het engineeren van cellen is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van celtherapeutica. Het elektroporatiesysteem van MaxCyte kan onbedoelde wijziging van het fenotype van cellen voorkomen en tegelijkertijd voldoen aan de belangrijkste behoeften op het gebied van celengineering: efficiëntie, consistentie, overdraagbaarheid en schaalbaarheid, aldus het bedrijf.
Virale transducties
Virale vectoren zijn vooral nuttig voor tranfectie van hele dieren of voor gebruik met weefsels die mogelijk moeilijk te bereiken zijn via chemische of elektroporatiebenaderingen. GenVec is gespecialiseerd in het gebruik van virale vectoren, met name het adenovirus, om genen af te leveren voor therapeutische doeleinden.
“Op het eerste gezicht lijken de problemen in verband met de immuunrespons op virale vectoren problematisch te zijn,” legt Doug Brough, Ph.D. uit. “We hebben echter ontdekt dat dit kan worden gebruikt om een immuunrespons op vreemd materiaal te stimuleren, zodat adenovirussen zouden kunnen worden gebruikt om vaccins af te leveren.”
Inderdaad heeft GenVec het adenovirus grondig bestudeerd en verschillende “smaken” van adenovirussen gegenereerd. Bij het onderzoeken van adenovirussen in andere soorten, zoals gorilla- en apensoorten, kunnen onderzoekers vectoren gebruiken die zijn ontworpen om de reeds bestaande immuniteit die de algemene menselijke bevolking tegen adenovirussen heeft, te vermijden.
“De grote bibliotheek van vectoren die door GenVec wordt aangeboden, wordt de Adenoverse™ genoemd,” informeert Dr. Brough. “We hebben grote delen van het adenovirus verwijderd om de aangeboren toxiciteit te beperken die gepaard gaat met de behandeling met adenovirus. Naast het voorkomen van een schadelijke immuunrespons op de vector, stelt dit ons in staat om tot 12 kb in het virus in te passen.”
Door gebruik te maken van een verscheidenheid aan benaderingen, heeft GenVec samengewerkt met een aantal bedrijven aan verschillende toepassingen, nucleïnezuurtherapieën, en gene-editing technologieën. Gemodificeerde adenovirussen kunnen zinkvingerbenaderingen leveren, zowel in vitro als in vivo.
Een voorbeeld van een dergelijke samenwerking is te vinden bij de klinische studie van Novartis om zintuigcellen in het binnenoor te regenereren. “Door cellen in het binnenoor te infecteren met een gen dat codeert voor een belangrijk regulerend eiwit, kunnen nieuwe mechanosensorische cellen worden gegenereerd ter vervanging van de cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van letsel of inherente genetische aandoeningen,” legt Dr. Brough uit.
Andere gezamenlijke projecten zijn te vinden met partnerschappen in entiteiten voor de behandeling van kanker en de ontwikkeling van vaccins. “Wanneer de tijd komt om een technologie te commercialiseren, gebruikt GenVec een cellijn die eerder door de FDA is goedgekeurd voor deze toepassingen,” verduidelijkt Dr. Brough.
“Een ander duidelijk voordeel van het gebruik van adenovirussen is dat ze gemakkelijk hele dieren kunnen transfecteren. Zo wordt bijvoorbeeld een verwoestende ziekte bij landbouwhuisdieren, mond- en klauwzeer genaamd, in stand gehouden door een verscheidenheid van virotypes. Met ons systeem kan snel worden omgeschakeld naar de stam die een uitbraak veroorzaakt en kan snel een op maat gemaakt vaccin worden toegediend,” aldus Dr. Brough.
Nucleofection
Lonza biedt een geavanceerde vorm van elektroporatie, Nucleofection™ genaamd, waarbij celspecifieke transfectieoplossingen worden gebruikt in combinatie met een genuanceerder puls-afgiftesysteem dat de transfectie van veel verschillende celtypen mogelijk maakt, met name normale primaire menselijke cellen.
“In plaats van standaardelektroporatiebufferoplossingen te gebruiken, gebruiken wij celspecifieke transfectieoplossingen”, zegt Gregory Alberts, Ph.D., een wereldwijde materiedeskundige bij Lonza. “Dit stelt ons in staat om de poriën te stabiliseren die ontstaan tijdens de pulstoediening. We speculeren dat de poriën die tijdens standaard elektroporatie in het celmembraan worden gevormd, zich snel sluiten. Onze technologie stabiliseert de poriën die door elektroporatie worden gevormd en maakt het mogelijk dat materiaal in de cel diffundeert en, meer specifiek, in de celkern.”
De Nucleofection-benadering maakt gebruik van veel verschillende substraten: DNA, mRNA, siRNA, peptiden, proteïnen en kleine moleculen. De transfectie-efficiëntie voor siRNA’s en mRNA’s is zeer goed, beter dan 90%. Kleine peptiden transfecteren meestal met ongeveer 80%, en de efficiëntie voor plasmide-DNA ligt tussen 50% en 90%, afhankelijk van het celtype. Zelfs grote substraten, grotere eiwitten zoals antilichamen of bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC’s), kunnen de doelcellen binnendringen met een redelijk effectieve transfectie-efficiëntie.
“Nucleofectie is verrassend flexibel,” verklaart Dr. Alberts. “Het is gebruikt om alle soorten primaire menselijke cellen te transfecteren. Het is gebruikt bij het genereren van iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen), de transfectie van CRISPR en andere genome-editing substraten, maar ook bij de transfectie van meer exotische doelwitten zoals de Plasmodium familie van parasieten die malaria veroorzaken. Andere soortgelijke organismen kunnen ook worden getransfecteerd met Nucleofection om onderzoek naar tropische ziekten mogelijk te maken.”
Het Nucleofection-platform is schaalbaar. Zo kan het high-throughput Nucleofection systeem 96-well en 384-well formaten verwerken. Vaak zal dit systeem worden gebruikt in een kernonderzoeksfaciliteit. Wetenschappers op de testbank kunnen de 4D Nucleofector met lagere doorvoer gebruiken om de testomstandigheden te optimaliseren. Omdat de 4D Nucleofector op de werkbank dezelfde transfectiecondities gebruikt, met dezelfde aantallen cellen werkt en dezelfde prestaties levert als de apparaten met een hogere capaciteit, hoeft de assay niet opnieuw te worden geoptimaliseerd wanneer het tijd is om naar een grotere schaal over te gaan.
“De continuïteit van het systeem maakt vergelijking van appels met appels als je schaal het project omhoog of omlaag,” illustreert Dr Alberts.
“We zijn in het proces van beta testen van een nieuw groot volume transfectie-apparaat dat in staat zal zijn om 200 miljoen tot 1 miljard cellen transfecteren in een formaat variërend van 1 tot 20 mL. Voorlopige resultaten tonen aan dat het apparaat primaire menselijke cellen of cellijnen transfecteert op dezelfde niveaus als de andere Lonza Nucleofector-apparaten,” vervolgt Dr. Alberts. “Dit product zal alleen voor onderzoeksdoeleinden worden vrijgegeven, hoewel er vanwege het vermogen van Nucleofection om primaire menselijke cellen zo goed te transfecteren, ongetwijfeld belangstelling zal zijn voor het gebruik van dit apparaat in meer klinisch georiënteerde toepassingen.”
Dr. Alberts voorziet dat Nucleofection een rol zou kunnen spelen bij innovatieve en gepersonaliseerde kankertherapieën, zoals chimere antigeen T-celtherapie (CAR-T), evenals andere celtherapieën die transfectie of genomische modificatie van primaire menselijke cellen vereisen.
“Het vermogen van Nucleofection om primaire menselijke T-cellen gemakkelijk en effectief te transfecteren, zal de aandacht trekken bij gentherapeutische benaderingen voor de behandeling van ziekten. Lonza’s benadering van potentiële gentherapietoepassingen heeft ook een zeer kleine voetafdruk. Dit is van cruciaal belang omdat ‘overgebleven’ machines van andere transfectietechnieken kunnen leiden tot onbedoelde biologische gevolgen,” concludeert Dr. Alberts.
Wetenschappers bij Lonza hebben geëvalueerd of de Nucleofection-technologie van het bedrijf in staat is om gedissocieerde volwassen aorta gladde spiercellen (AoSMC’s) van ratten te transfecteren. Cryobewaarde AoSMC’s van ratten werden ontdooid en gedurende zeven dagen gekweekt in kweekplaten met 24 putjes, en de cellen werden getransfecteerd in adhesie met behulp van AD1 4D-Nucleofector Y-oplossing. Vierentwintig uur na de transfectie, werden cellen gefixeerd en geanalyseerd. Actine wordt weergegeven in rood; GFP, in green.
Formuleringen
Mirus Bio ontwikkelt en produceert nieuwe transfectie formuleringen, die zorgen voor een hoge efficiëntie en lage toxiciteit levering van veel verschillende soorten nucleïnezuur moleculen. Veel van de formuleringen zijn vrij van dierlijke bestanddelen. “Dierproefvrij” is een belangrijke kwaliteit voor preklinische en klinische toepassingen.
Het CRISPR-systeem vereist de levering van een gids-RNA (gRNA) en expressie van het Cas9-endonuclease, dat kan zijn in de vorm van eiwit, mRNA, of DNA. Mirus Bio biedt transfectieoplossingen om de effectieve levering van alle verschillende Cas9-coderende moleculen te ondersteunen. Bij gebruik van chemische transfectiemethoden voor de levering van Cas9-eiwit, kunnen onderzoekers veel lagere niveaus van eiwit gebruiken als het is geprecomplexeerd met de gRNA.
“Sommige moeilijk te transfecteren celtypen leveren hogere splitsingsefficiënties op met de transfectie van het Cas9-eiwit gecomplexeerd binnen het RNP (ribonucleoproteïne)-complex,” verklaart Laura Juckem, Ph.D., R&D groepsleider bij Mirus Bio. “Het Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System levert effectief RNP-complexen en maakt het mogelijk om lagere concentraties Cas9-eiwit te gebruiken in vergelijking met elektroporatie.”
Een andere uitdaging waarmee bedrijven worden geconfronteerd, is de overstap van adherente naar suspensieculturen om de grote hoeveelheid materiaal die nodig is voor klinische proeven te kunnen huisvesten. Dit geldt met name voor de productie van recombinant lentivirus en adeno-geassocieerd virus (AAV). “We werken nauw samen met onze klanten om ervoor te zorgen dat hun transfecties succesvol zijn en dat veranderingen in hun workflow nog steeds een product van hoge kwaliteit opleveren,” legt Dr. Juckem uit.
“Voor celtherapie werd het CHO-gro® Expression System ontwikkeld om hoge biotherapeutische eiwitopbrengsten te geven in suspensie CHO-cellen. Dit geoptimaliseerde systeem bevordert een hoge dichtheid van celgroei en stelt onderzoekers in staat om voldoende eiwitten te verkrijgen voor het uitvoeren van preklinische studies en eerste karakteriseringsanalyses,” besluit Dr. Juckem.
Deze afbeelding, afkomstig uit een presentatie van Mirus Bio waarin de zeer efficiënte transfectie van stamcellen wordt beschreven, geeft aan dat somatische cellen zoals volwassen fibroblastcellen via verschillende methoden kunnen worden getransfecteerd of getransduceerd met een combinatie van transcriptiefactoren. Zodra de cellen zijn geherprogrammeerd tot een pluripotente toestand, kunnen ze worden geleid tot verschillende lotgevallen door middel van toevoeging van groeifactoren en / of transfectie van selectie markers gedreven door celtype-specifieke promotors. De afbeelding benadrukt dat transfectiereagentia op verschillende punten aan een stamcelworkflow kunnen worden toegevoegd.
Whole-Animal Approaches
Thermo Fisher Scientific blijft op de hoogte van de behoeften van klanten om meer biologisch relevante gegevens te genereren met behulp van primaire cellen, in plaats van geïmmortaliseerde cellijnen. Primaire cellen zijn van oudsher moeilijker te transfecteren met chemische methoden. Gegevens gegenereerd uit primaire celculturen hebben echter de neiging antwoorden te geven die zich beter laten vertalen naar in vivo modellen voor hele dieren.
Driedimensionale celcultuurmodellen, die relevantere resultaten opleveren dan tweedimensionale celculturen, zijn moeilijker te transfecteren met traditionele methoden.
“Transfectie van primaire culturen met DNA is een uitdaging. Het gebruik van siRNA (klein remmend ribonucleïnezuur), mRNA (boodschapper-RNA) en eiwit direct wordt gemakkelijker geaccepteerd door primaire cellen, omdat deze verbindingen alleen hoeven te worden afgeleverd aan het cytoplasma en niet de celkern,” verklaart Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D., directeur R&D bij Thermo Fisher Scientific.
“Afgifte aan de celkern gebeurt als de cellen zich delen,” vervolgt Dr. de Mollerat “Aangezien primaire cellen zich niet zo gemakkelijk delen als cellijnen, kunnen we het probleem omzeilen door moleculen af te leveren aan het cytoplasma in plaats van aan de celkern.”
Ter voortzetting van de zoektocht naar meer biologisch relevante systemen in hele dieren, “hebben we ontdekt dat in vivo gebruik van Invivofectamine® 3.0 effectief de expressie van een eiwit met 90% kan uitschakelen in levercellen,” articuleert Dr. de Mollerat. “Dit in vivo gebruik van Invivofectamine geeft wetenschappers een effectiever model van hoe behandelingen eruit zien in het hele dier.”
Een andere toepassing van transfectietechnologie is de ontwikkeling van vaccins. De tijdlijn voor de ontwikkeling van vaccins kan enorm worden verkort door getransfecteerde mRNA’s te gebruiken om antigenen tot expressie te brengen waartegen het lichaam een immuunrespons kan ontwikkelen. Gezien het aantal nieuwe virussen die in de wereld worden aangetroffen, zoals Zika en chikungunya, zal de mogelijkheid om snel vaccins te ontwikkelen de wereldgezondheid sterk verbeteren.
Met de voortdurende ontwikkeling van immuuntherapieën gericht tegen kankers, worden T-cellen vaak gericht met specifieke receptoren. “Wij hebben samengewerkt met bedrijven die geïnteresseerd zijn in de ontwikkeling van deze therapieën,” licht Dr. de Mollerat toe. “We werken nauw samen met bedrijven om de vragen aan te pakken hoe deze behandelingen te produceren, deze behandelingen op grote schaal te maken en ze wereldwijd beschikbaar te maken.”
Invivofectamine 3.0 is een reagens dat wordt geleverd door Thermo Fisher Scientific voor in vivo RNAi-afgifte. Volgens het bedrijf resulteert een enkele injectie in een significante knockdown op dag 1 en tot 3 weken lang. Deze bevinding kwam naar voren uit een studie waarbij het reagens in verschillende doses (1, 0,5, en 0,25 mg/kg) in de staart van een knaagdier werd geïnjecteerd. Serum werd verzameld op dagen 2, 5, 9, 16, 23, en 30, en serum werd geanalyseerd op FVII-eiwit knockdown door middel van een chromogene assay. Het bedrijf merkte op dat grotere hoeveelheden siRNA in de geïnjecteerde complexen leidden tot een langduriger knockdown over het gehele geteste bereik.