Transfer RNA

1 Inleiding

tRNA vouwing en stabiliteit is cruciaal voor efficiënte translatie, en defecten in een van beide eigenschappen kan leiden tot verminderde hoeveelheden tRNA, wat resulteert in groeistoornissen in gist en ziekte bij de mens (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). In de gist Saccharomyces cerevisiae zijn er twee belangrijke cellulaire kwaliteitsbewakingstrajecten bekend voor de afbraak van defecte tRNA-soorten. De eerste route is de nucleaire bewakingsroute, die inwerkt op pre-tRNA in de kern door gebruik te maken van het nucleaire exosoom en het TRAMP-complex (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) door afbraak van pre-tRNAiMet zonder de m1A58 modificatie of met een verkeerd verwerkte 3′ trailer (Ozanick et al., 2009) en een fractie van wild-type (WT) pre-tRNAs (Gudipati et al., 2012). De tweede route is de snelle tRNA-afbraakroute (RTD), die specifieke rijpe, gehypomodificeerde of gedestabiliseerde tRNA-soorten afbreekt door de activiteit van de 5′-3′ exonucleasen Rat1 en Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD wordt opgewekt in mutanten die een van de verschillende modificaties in het lichaam van het tRNA missen of door destabiliserende mutaties, en voor alle geïdentificeerde RTD-substraten herstelt MET22-deletie de tRNA-niveaus en de groei volledig (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Onderdrukking van RTD in met22Δ stammen wordt verondersteld te wijten te zijn aan remming van de exonucleasen Rat1 en Xrn1 door de metaboliet 3′-fosfoadenosine-5′-fosfaat, die verhoogde niveaus heeft wanneer Met22 wordt geremd (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).

In de tweede benadering werden noordelijke blots gebruikt om zowel de snelheid als de specificiteit van de tRNA-afbraak voor RTD-substraten in temperatuursgevoelige modificatiemutanten te onderzoeken. In deze benadering, RNA geïsoleerd uit cellen op verschillende tijdstippen na temperatuurverschuiving werd geanalyseerd op niveaus van specifieke tRNAs. Uit deze analyse bleek dat 50% van het tRNAVal(AAC) werd afgebroken in een trm8Δ trm4Δ mutant binnen 30 min na een verschuiving van 28 naar 37 °C, terwijl de op vergelijkbare wijze gehypomodificeerde tRNAiMet, tRNAMet, en tRNAPhe geen afname vertoonden (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Voorts konden de relatieve niveaus van geladen en ongeladen tRNA worden gemeten door de noordelijke blot onder zure omstandigheden uit te voeren, waaruit bleek dat de niveaus van geladen tRNAVal(AAC) met 50% waren verlaagd binnen 25 min van de temperatuurverschuiving in een trm8Δ trm4Δ mutant en dat de niveaus van ongeladen tRNAVal(AAC) onaangetast leken (Alexandrov et al, 2006).

De derde benadering was door middel van high-copy tRNA onderdrukking, waarbij een high-copy plasmide die een bepaald tRNA tot expressie brengt werd ingebracht in een temperatuursgevoelige tRNA modificatie mutant. Als het tRNA een RTD-substraat was en de temperatuurgevoeligheid het gevolg was van de afbraak van een enkel tRNA-substraat, dan zou overexpressie van het tRNA het defect onderdrukken. Zo vonden wij dat de temperatuurgevoeligheid van een trm8Δ trm4Δ mutant onderdrukt werd door een hoog-gekopieerd plasmide dat tRNAVal(AAC) tot expressie bracht, wat erop wijst dat de temperatuurgevoeligheid hoofdzakelijk te wijten was aan het verlies van tRNAVal(AAC), en dat de ontbrekende modificaties belangrijk waren voor de stabiliteit van het tRNA (Alexandrov et al., 2006). Ook de RTD-substraten van verschillende andere tRNA-modificatiemutanten zijn met deze aanpak geïdentificeerd, waaronder tRNASer(CGA) en tRNASer(UGA) in tan1Δ trm44Δ-mutanten (die ac4C12 en Um44 missen) en in trm1Δ trm4Δ-mutanten (die m2,2G26 en m5C missen) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).

Vierde, wij gebruikten een genetische vervangingsbenadering om RTD-determinanten in de tRNASer-familie te identificeren door het enkele essentiële tRNASer(CGA)-gen (SUP61) te vervangen door verschillende tRNASer(CGA)-varianten in de WT- en de met22Δ-stam, en vervolgens de groei bij verschillende temperaturen te testen. Met deze aanpak stelden wij vast dat de gecombineerde acceptor- en T-stamstabiliteit sterk bepalend waren voor RTD-gevoeligheid in de tRNASer(CGA)-genfamilie (Whipple et al., 2011). Deze conclusie werd verder ondersteund door een vijfde benadering om RTD te meten, waarin we in vitro aantoonden dat tRNASer(CGA) varianten die ac4C12 en Um44 misten, of met destabiliserende mutaties in de acceptorstam, gevoeliger waren voor vertering door Xrn1 en gevoeliger voor 5′ fosfaatverwijdering door kalfs-intestinale fosfatase (Whipple et al,

In dit overzicht bespreken we onze recent ontwikkelde zesde en zevende benadering voor de studie van RTD-substraten, die zeer waardevol zijn gebleken bij het verbreden van ons begrip van de RTD-route. De zesde benadering maakt gebruik van een fluorescerende reporter om bibliotheken van duizenden tRNA-varianten in WT- en met22Δ-stammen uitvoerig te analyseren. Met deze aanpak hebben we 643 waarschijnlijke RTD-substraatkandidaten geïdentificeerd, waarvan vele in regio’s waarvan op basis van eerder werk niet werd verwacht dat ze RTD zouden uitlokken (Guy et al., 2014). We zullen gegevens laten zien die aantonen dat deze aanpak kan worden gebruikt om de tRNA-functie onder verschillende omstandigheden te bestuderen en zullen andere toepassingen van de aanpak bespreken.

De zevende aanpak maakt gebruik van gif primer extensie om de tRNA-niveaus in een WT en met22Δ stam te meten en is waardevol in zijn vermogen om specifiek een variant tRNA te meten, zelfs in aanwezigheid van het WT tRNA waarvan de sequentie kan verschillen door slechts een enkel residu. Wij geven een gedetailleerde methodologie van deze aanpak en bespreken enkele van zijn andere mogelijke toepassingen.