Tumor Xenograft

Characterization of Xenograft Banks

Werken met PDX-tumoren vereist het opzetten en onderhouden van een tumorbank, die in muizen wordt geïmplanteerd en vervolgens in serie wordt overgedragen van generatie op generatie, tenzij deze keten van gebeurtenissen wordt onderbroken door het invriezen van monsters. Aangenomen wordt dat PDX de morfologische kenmerken van de oorspronkelijke tumor preciezer reproduceren dan xenograften van gevestigde cellijnen, in termen van histologische en genetische profilering. Zij reproduceren de heterogeniteit van menselijke kankers en hebben een betere waarde voor het voorspellen van de respons op behandeling.8-16

Inflammatoire laesies zijn over het algemeen gemakkelijk te identificeren door histologische methoden. Bij tumoren daarentegen kan het moeilijker zijn om vast te stellen of het om de verwachte tumor gaat of dat deze een andere oorsprong heeft. Inderdaad kunnen tumoren bij muizen ontstaan op de plaats van xenograften. De meeste van dergelijke tumoren zijn lymfomen (Fig. 4.2B),11 maar fusiforme cel sarcomen (Fig. 4.2C) worden soms waargenomen, en andere murine tumoren, zoals borstklier tumoren in het subcutane weefsel van vrouwelijke muizen, kan ook worden waargenomen in zeldzame gevallen. Spontane tumoren of tumorachtige laesies kunnen zich ook in verre organen ontwikkelen en verkeerd worden geïnterpreteerd als mogelijke metastasen (bv. longadenomen; Fig. 4.2D). Eenvoudig morfologisch onderzoek van het weefsel geeft over het algemeen duidelijk aan of de tumor van hetzelfde type is als de oorspronkelijke menselijke tumor. Dit geldt in het bijzonder voor de meeste carcinoomxenograften, die een morfologie hebben die sterk verschilt van die van lymfomen of sarcomen. Carcinomen bestaan over het algemeen uit grote cellen, duidelijk gerangschikt in koorden, tubuli of lobben met een prominent bindweefselinterstitium. Lymfomen (zowel bij mensen als bij muizen) bestaan uit bladen van kleine ronde cellen met een schaars stroma, en sarcomen bestaan uit stromen van puistvormige cellen. Het is dus gemakkelijk om deze verschillende soorten tumoren op het oog van elkaar te onderscheiden. De diagnose kan moeilijker zijn als de oorspronkelijke tumor een “blauwe tumor” is, een tumor die bestaat uit kleine cellen met zeer weinig cytoplasma en een hyperchromatische kern, die sterk basofiel (blauw van kleur) lijkt onder een microscoop bij lage vergroting na kleuring met hematoxyline en eosine (H&E). Blastische tumoren, zoals retinoblastoom, zijn typisch blauwe tumoren. In dergelijke gevallen kan de morfologie van de tumor moeilijk te interpreteren zijn, vooral omdat de meest specifieke kenmerken van sommige tumoren, zoals de rozetten van veel blastische tumoren, in het algemeen ontbreken of slecht vertegenwoordigd zijn in xenograften. Anaplastische tumoren, waarbij de tumorcellen weinig of geen morfologische gelijkenis vertonen met normale cellen, kunnen ook moeilijk te karakteriseren zijn zonder aanvullende technieken. Zoals gezegd is het betrekkelijk gemakkelijk om sarcoom van lymfoom of goed gedifferentieerd carcinoom te onderscheiden, maar het onderscheiden van sarcoom xenograften van ontstekingsletsels of muriene sarcomen kan een uitdaging zijn, omdat deze letsels een zeer vergelijkbare morfologie kunnen hebben.6

Bij moeilijke gevallen, of gewoon om te bevestigen dat een tumor echt van menselijke oorsprong is alvorens een experiment te beginnen, kunnen verschillende methoden worden gebruikt om soortspecifieke eiwitten of nucleotidesequenties aan te tonen, gebaseerd op immunohistochemie of in situ hybridisatie, om menselijke of muriene cellen te identificeren. Immunohistochemische karakterisering van eiwitten die kenmerkend zijn voor een cellijn is nuttig om het weefsel van oorsprong van de tumor te specificeren.

Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de mogelijke ontwikkeling van humane lymfomen op de plaats van enting van niet-lymfoïde tumoren, meestal tijdens de eerste implantatie.11 Dergelijke tumoren dragen de specifieke merkers van humane cellen; dit kan leiden tot verwarring met een echte xenograft indien geen morfologisch onderzoek van de laesie wordt uitgevoerd. In PDX-studies blijken de meeste waargenomen humane lymfomen zich te ontwikkelen uit lymfocyten die aanwezig zijn in het weefselmonster dat voor de eerste enting is gebruikt. Indien deze cellen besmet zijn met het Epstein-Barr virus (EBV), kunnen de B-lymfocyten een transformatie ondergaan om tumorcellen te worden.17,18 Bij immunocompetente mensen worden deze cellen efficiënt door het immuunsysteem geëlimineerd, terwijl bij enting in immuungecompromitteerde muizen de kwaadaardige B-cellen zich kunnen ontwikkelen en de plaats kunnen innemen van de aanvankelijke menselijke tumor.11 In de PDX-context zijn ook enkele gevallen van EBV-negatieve perifere humane T-cellymfomen beschreven.19 Indien de oorspronkelijke humane tumor duidelijk verschillend was van een lymfoom (b.v. een adenocarcinoom), dan is de ontwikkeling van een humaan lymfoom gemakkelijk te beheersen, aangezien een eenvoudig morfologisch onderzoek volstaat om aan te tonen dat de tumor die op de entplaats groeit niet van het verwachte type is en derhalve moet worden verworpen. Indien de oorspronkelijke tumor een “blauwe tumor” was, dan kan het aantonen dat de tumor die op de entplaats wordt aangetroffen van menselijke oorsprong is, bij gebrek aan verdere karakterisering tot misinterpretatie leiden, omdat deze tumor in feite een menselijk lymfoom kan zijn dat het gevolg is van de kwaadaardige transformatie van EBV-geïnfecteerde lymfocyten die in de oorspronkelijke tumor aanwezig waren, zoals eerder besproken.

Wanneer een xenograft tot stand is gebracht (PDX-tumoren worden in het algemeen geacht gestabiliseerd te zijn na drie tot vijf passages20), moet deze worden gekarakteriseerd, zowel wat betreft het histologische type als wat betreft de differentiatie. Het histologische type van de tumor blijft in xenograften over het algemeen goed bewaard, zodat bijvoorbeeld epidermoïdcarcinomen en tubulare adenocarcinomen dezelfde kenmerken hebben wanneer zij PDX vormen.21 Deze fenotypische stabiliteit wordt geacht verband te houden met biochemische stabiliteit, omdat het onwaarschijnlijk is dat uitgesproken biochemische veranderingen zouden leiden tot het behoud van morfologische kenmerken.6 De eerste vraag die de patholoog zich daarom moet stellen, is of de aanwezige tumor de morfologische en biochemische kenmerken van het uitgangsweefsel reproduceert.17 Als dat niet het geval is, kan het gaan om een tumor van een muis, of kan er een belangrijke verandering zijn opgetreden in het differentiatiepatroon van de tumor, hetgeen nader onderzoek vereist.8

Bij sommige transplantaties van de eerste generatie en in toenemende mate na verdere passages kunnen sommige tumoren echter de neiging vertonen minder gedifferentieerd te worden, met minder ducten of acini in adenocarcinomen, en meer mitose, nucleair pleomorfisme, en atypie.20

Specifieke morfologische details kunnen veranderen tijdens seriële passages, met verwerving van mucine secretie of van neuro-endocriene differentiatie, bijvoorbeeld, die beide criteria zijn voor tumorprogressie in sommige carcinomen (bijv. prostaatkanker).22 Evenzo kan het patroon van tumordifferentiatie worden gewijzigd door wijzigingen in de engraftment omstandigheden, met veranderingen in de hormonale status van de gastheer als gevolg van castratie of hormonale suppletie, bijvoorbeeld.22

Het bepalen of de morfologie van de tumor na enting, seriële passages of experimenten behouden blijft, is een van de moeilijkheden waarmee pathologen worden geconfronteerd. Onafhankelijke xenograften van dezelfde tumor zijn immers nooit strikt identiek ten gevolge van biologische variabiliteit en intratumor heterogeniteit. Zelfs verschillende secties van dezelfde tumor en verschillende regio’s van dezelfde sectie kunnen morfologische verschillen vertonen. De morfologische kenmerken van de cellen en hun kernen, hun ruimtelijke ordening, de mitotische index en de aanwezigheid van atypische mitoses, het aantal apoptotische lichaampjes en de frequentie van necrose, de overvloed aan stroma en de vasculatuur verschillen tussen de coupes en tussen de velden. De patholoog moet derhalve bepalen of het globale patroon van de tumor behouden is gebleven en, wat belangrijker is, of de histologie van de xenogetransplanteerde tumor overeenkomt met die van de oorspronkelijke donortumor. Internationale classificaties van humane tumoren moeten worden gebruikt als basis voor een nauwkeurige pathologische classificatie van xenograften, maar enige mate van flexibiliteit is vereist, omdat xenograften nooit perfect de morfologie van de oorspronkelijke humane tumor reproduceren.

Wanneer xenograften gedurende opeenvolgende passages of gedurende experimenten worden gevolgd, kunnen kwalitatieve veranderingen, zoals een overgang van een trabeculair naar een tubulair patroon, indien reproduceerbaar, als significant worden beschouwd, terwijl kwantitatieve veranderingen, zoals veranderingen in de mitotische index of de hoeveelheid necrose, vooral wanneer deze subtiel zijn, met grote voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd.

Een andere moeilijkheid bij de histologische analyses van tumorxenobanken vloeit voort uit het deels subjectieve karakter van de morfologische analyse. Als waarnemers de morfologie van een bepaald type tumor goed kennen, dan is hun perceptie fijn afgesteld om kleine details te detecteren die mettertijd duidelijker kunnen worden. Het is raadzaam een staal van gestabiliseerde PDX te selecteren dat als referentie kan dienen voor vergelijking met nieuwe stalen, om ervoor te zorgen dat de objectglaasjes zo objectief mogelijk worden gelezen. Een digitale bank van virtuele objectglaasjes kan deze taak aanzienlijk vergemakkelijken. Als er geen duidelijk verschil kan worden waargenomen tussen het testglaasje en de referentie, kan de laesie als “gelijksoortig” worden beschouwd; dit betekent niet dat zij identiek zijn, alleen dat er geen significante morfologische veranderingen kunnen worden waargenomen.

Voor het eerste monster dat in een xenograft-experiment wordt waargenomen, moet de referentie een monster zijn van de oorspronkelijke menselijke tumor, of ten minste een morfologische beschrijving hebben als de betrokken tumor in het pathologieverslag van de patiënt. Indien een dergelijke referentie niet beschikbaar is, kan de patholoog eenvoudigweg zeggen dat de tumor “morfologisch compatibel” is met een xenograft van een menselijke tumor van een bepaalde categorie.