Materialen:
30 ml exponentiële SF9-celkweek bij 5×105 cellen/ml
6-wellplates (2 per stuk)
1-fles 4% Agarose Gel
1-fles SF-900 (1..3X) medium
1 steriele fles
0,5ml baculovirus supernatant
100ml SFM
1. Breng onder steriele omstandigheden 2 ml celsuspensie per putje aan.
2. Laat de cellen zich op de bodem van de plaat afzetten en incubeer afgedekt bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
3. Plaats de fles agarosegel in het waterbad van 70oC. Plaats de lege fles en de SF-900 (1.3X) in het 40oC bad.
4. Na 1 uur incubatie van de platen bij RT, observeer monolayers onder de invertedmicroscoop om celhechting en 50% confluentie te bevestigen.
5. Produceer een 8-log seriële verdunning van het geoogste virale supernatant door achtereenvolgens 0,5 ml van de vorige verdunning te verdunnen in 4,5 ml SFM-medium in 12-mldisposable. U moet eindigen met 8 buisjes die elk een verdunning van 10-1 tot 10-8 van de oorspronkelijke virusvoorraad bevatten.
7. Verwijder achtereenvolgens het supernatans uit elk putje, gooi het weg en vervang het onmiddellijk door 1 ml van de respectieve virusverdunning in elk in duplo aangelegd putje. Incubeer gedurende 1 uur bijRT.
8. Verplaats de flessen van de waterbaden naar de steriele kap wanneer de agarose vloeibaar is (20 tot 30 min).Breng snel 30 ml van het SF-900-medium (1.3X) en 10 ml van de 4% agarosegel in de lege fles en meng voorzichtig. Plaats het flesje met plaquing-overlay terug in het waterbad van 40oC tot gebruik.
9. Na deze tweede incubatie van 1 uur, het flesje met verdunde agarose en de 6-well-platen terug in de kap plaatsen.
10.Verwijder achtereenvolgens (van hoge naar lage verdunning) het virus uit de putjes en vervang door 2 ml van de verdunde agarose. Een pasteurpipet aangesloten op een vacuümpomp verwijdert gemakkelijk inoculumsporen.
11.Laat de gel 10 tot 20 min. uitharden alvorens te verplaatsen.
12.Incubeer bij 27oC in een bevochtigde incubator gedurende 4 tot 10 dagen.
13.Recombinantvirus produceert melkachtige/grijze, weinig contrasterende plaques die zonder kleuring of andere opsporingsmethoden zichtbaar zijn.
14.Monitorplaten dagelijks totdat het aantal getelde plaques gedurende twee opeenvolgende dagen niet verandert.
15.Om de titer van het gebruikte inoculum te bepalen, is een optimaal bereik om 3 tot 20 plaques per putje van een plaat met 6 putjes te tellen. De titer (pfu/ml) kan met de volgende formule worden berekend:
16. Overlay van agarose met Natural Red kleurstof:
Prepareer 0,5% agaroseoplossing in SFM
Voeg Natural Red-oplossing toe tot een eindconcentratie van 50mg/ml (verdun 3,33mg/ml voorraad 1:66,6).
Overleg 1 ml van de kleurstofoplossing in elk putje (op een plaat met 6 putjes).