[4] Porównanie wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego i jego zdestabilizowanej formy jako reporterów transkrypcji

W niniejszym rozdziale opisano użyteczność zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) jako genu reporterowego w badaniu ekspresji genów. GFP emituje światło fluorescencyjne przy wzbudzeniu, bez dodatku substratu lub kofaktora, zarówno in vivo jak i in vitro. Aktywność fluorescencji GFP może być wykrywana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, fluorometru, urządzenia do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) lub czytnika mikropłytek z obrazowaniem. Ulepszony GFP (EGFP) jest mutantem GFP o jaśniejszej fluorescencji, co czyni detekcję znacznie bardziej czułą. Wykorzystanie GFP jako genu reporterowego oferuje wiele korzyści. Należą do nich: analiza w czasie rzeczywistym, minimalna obsługa próbki, możliwość analizy dużych ilości oraz wysoka czułość. Jednakże, GFP jest białkiem stabilnym, więc łatwo ulega akumulacji po ekspresji w komórkach. Akumulacja sprawia, że indukowana ekspresja reportera jest niewrażliwa na jakiekolwiek zmiany w indukcji i dlatego trudno byłoby ją wykorzystać w badaniach kinetyki. W tym rozdziale omówiono użyteczność EGFP i zdestabilizowanego EGFP (dEGFP) jako reporterów transkrypcji poprzez połączenie ich z sekwencją wiążącą NF-KB i promotorem kinazy tymiklinowej (TK) oraz porównanie różnic w ekspresji pomiędzy EGFP i dEGFP. Stwierdzono, że zarówno EGFP jak i dEGFP mogą być stosowane jako repetytory w badaniach transkrypcji. Ponadto, dEGFP jest bardziej wrażliwy w odpowiedzi na zmiany w leczeniu czynnikiem martwicy nowotworów (TNF) dzięki szybszemu tempu obrotu.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.