Bacterial co-culture with cell signaling translator and growth controller modules for autonomously regulated culture composition

SygnałAI-1 kontroluje tempo wzrostu komórek

Pierwej przetestowaliśmy kontrolę tempa wzrostu komórek E. coli poprzez transkrypcyjną regulację ptsH, genu zaangażowanego w transport cukrów. HPr (kodowany przez ptsH) jest powszechnie rozpoznawany jako jedno z serii białek (np. E1, HPr, EII), które sekwencyjnie przenoszą grupę fosforylową z fosfoenolopirogronianu (PEP) na glukozę (lub inny węglowodan PTS)34. HPr jest wysoce konserwatywny37. Ostatnio odkryliśmy, że HPr oddziałuje z kinazą AI-2 LsrK, wpływając na wychwyt AI-235. Funkcjonalność modulującą AI-2 wykorzystaliśmy później podczas konstruowania komórki wyczuwającej AI-2. Wykazaliśmy, że szczepy zmutowane ptsH rosną wolniej niż szczepy typu dzikiego w podłożu minimalnym zawierającym glukozę (Supplementary Fig. 1a). Kiedy ptsH został umieszczony pod indukowalnym promotorem IPTG w mutancie ptsH, tempo wzrostu mogło być kontrolowane w oparciu o dodatek IPTG (Supplementary Fig. 1b). Co ważne, wykazaliśmy, że indukowanie ekspresji ptsH skutkuje wzrostem tempa wzrostu komórek. Co równie ważne, zachowanie to jest niezależne od tego, czy pożywka zawiera glukozę jako główne źródło węgla, czy też nie (Supplementary Fig. 1c).

W oparciu o ten dowód słuszności koncepcji, skonstruowaliśmy następnie sygnał QS kontrolujący tempo wzrostu. Aby skonstruować szczep kontrolny, ptsH został umieszczony pod kontrolą promotora AI-1 lasI QS na plazmidzie pAHL-HPr (Rys. 2a) w zmutowanym szczepie ptsH PH04. W innym miejscu plazmidu zarówno dsRedExpress2, służący do wizualizacji komórek, jak i LasR, wymagany do aktywacji promotora lasI, ulegały ekspresji pod konstytutywnym promotorem T5. Dodanie AI-1 do szczepu kontrolnego zwiększało tempo wzrostu komórek do 1,8 razy w stosunku do tempa wzrostu wyjściowego w sposób zależny od dawki (Rys. 2b). Zmierzona specyficzna szybkość wzrostu (pomiędzy 1 a 4 h po dodaniu AI-1) posłużyła jako podstawa do stworzenia modelu typu Monoda szybkości wzrostu opartego na poziomie AI-1 (Rys. 2c).

AI-1 moduluje skład we współkulturach komórek regulatorowych

Komórki regulatorowe regulowane AI-1 były następnie współkulturowane z innymi szczepami w celu sprawdzenia, czy dodanie AI-1 zmieniło skład współkultury. Komórki regulatora wzrostu wyrażające białko czerwonej fluorescencji (PH04 pAHL-ptsH) były współkulturowane albo z PH04 pCT6 albo TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 ma podobną podstawową szybkość wzrostu do PH04 pAHL-ptsH, podczas gdy TOP10 pT5G rośnie znacznie szybciej. Hodowle były inokulowane przy w przybliżeniu równych gęstościach komórek i uzupełniane różnymi poziomami AI-1. Po 8 h pobierano próbki do analizy przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i kwantyfikowano je przy użyciu ImageJ. Zgodnie z oczekiwaniami, gdy komórki regulatorowe hodowano z PH04, skład hodowlany komórek regulatorowych zwiększał się wraz ze wzrostem stężenia AI-1 (Rys. 3a). Podobny trend zaobserwowano, gdy komórki hodowano z TOP10, pomimo szybszego tempa wzrostu TOP10 (Rys. 3b). Oznacza to, że we współkulturach bez AI-1, frakcja komórek regulatorowych we współkulturach z TOP10 faktycznie znacząco spadła z początkowego poziomu ~0,5 do ~0,09 w ciągu kolejnych 8 h. Dodanie AI-1 przeciwdziałało tej różnicy w tempie wzrostu i skutkowało wyższym poziomem komórek regulatorowych w tym samym 8-godzinnym okresie. Wyniki te pokazują, że niezależnie od innych szczepów w hodowli i ich odpowiednich szybkości wzrostu, AI-1 (który nie jest cząsteczką sygnalizacyjną QS E. coli) moduluje szybkość wzrostu zmodyfikowanego szczepu kontrolera, a zmiana nastąpiła wystarczająco szybko, aby umożliwić obserwowalną zmianę w składzie hodowli – zwłaszcza nawet w warunkach stosunkowo krótkotrwałej hodowli okresowej (w przeciwieństwie do hodowli okresowych, wielokrotnych lub ciągłych).

Następnie, szczep kontrolera regulowanego przez AI-1 był współkulturowany z komórkami, które produkują AI-1, gdy są indukowane. PH04 pSox-LasI i PH04 pAHL-HPr były hodowane razem. Plazmid pSox-LasI zawiera lasI, który syntetyzuje AI-1, pod indukowanym pyocyjaniną promotorem soxS7. W tym eksperymencie, szczep kontrolera otrzymuje sygnał od szczepu translatora, który z kolei produkował AI-1 w odpowiedzi na pyocyaninę. W ten sposób pokazano, że schemat kontroli współkultury odpowiada na konkretną wskazówkę molekularną. Tutaj, każda hodowla była zaszczepiona w przybliżeniu równą gęstością początkową, a współkultury były albo wystawione na działanie pycyjaniny, albo nie. Hodowle naświetlane wykazywały zwiększoną produkcję AI-1 i odpowiadający jej zwiększony skład PH04 pAHL-HPr w ciągu 5 h (Rys. 3c). Wyniki te pokazują, że AI-1 produkowany z alternatywnego szczepu może modulować tempo wzrostu szczepu kontrolnego, i że może to zachodzić w skali czasowej wymaganej do zmiany w procesie wsadowym. Dodatkowo, pokazuje to potencjalną wykonalność regulowanej przez użytkownika ko-kultury opartej na specyficznej dla użytkownika aplikacji cząsteczki lub induktora, w tym przypadku piocjaniny. Następnie zaprojektowaliśmy szczep translatora, aby stworzyć autonomicznie regulowaną współkulturę opartą na wszechobecnej cząsteczce sygnalizacyjnej AI-2.

Projekt komórek translatora wyczuwających AI-2

Aby skonstruować linie komórkowe wyczuwające AI-2 i produkujące AI-1, zaprojektowaliśmy szczepy aktywujące ekspresję LasI, która syntetyzuje AI-1, kiedy promotor AI-2 lsr jest aktywowany. Użyliśmy systemu dwóch plazmidów, aby wzmocnić ekspresję ze słabego promotora lsr25 (Rys. 4a). Krótko mówiąc, AI-2 jest fosforylowana przez LsrK, a fosforylowana AI-2 zwalnia represję promotora przez LsrR, zwiększając transkrypcję genów transportera lsr i przyspieszając pobór AI-2. Jednocześnie, pośredniczona przez AI-2 aktywacja promotora lsr powoduje transkrypcję polimerazy T7 RNA z plazmidu pCT6 i następczą transkrypcję lasI z plazmidu pET-LasI.

System został po raz pierwszy skonstruowany w szczepie gospodarza E. coli CT104, który jest mutantem luxS (np. niezdolnym do produkcji AI-2). W CT104 brakuje również lsrFG, odpowiedzialnego za degradację fosforylowanego sygnału AI-2, co zwiększa wrażliwość komórki na AI-238. Sprawdziliśmy, czy ta linia komórkowa, CT104 pCT6 pET-LasI, produkowała AI-1, gdy była hodowana w podłożu kondycjonowanym (CM) z BL21 produkującego AI-2 (Supplementary Fig. 2). BL21 hodowano do różnych gęstości komórek, zbierano CM, a komórki CT104 hodowano w zebranej CM. Co ważne, AI-1 produkowany przez komórki CT104 korelował z gęstością komórek BL21 produkujących AI-2 (Supplementary Fig. 2a). Sprawdziliśmy również, czy komórki translatora dodane do konsorcjów zawierających różne frakcje komórek produkujących AI-2 mogą produkować sygnał AI-1 w zależności od składu konsorcjum. Komórki CT104 dodawano do hodowli o różnym stosunku BL21 (luxS+) do BL21 ΔluxS. Po 6 h poziom sygnału AI-1 w mediach pozakomórkowych wskazywał na skład hodowli, który z kolei opiera się przede wszystkim na początkowej frakcji komórek luxS+25 (Supplementary Fig. 2b).

Powyższe eksperymenty wykazały, że można skonstruować linię komórkową do produkcji AI-1 w odpowiedzi na AI-2 z komórek produkujących AI-2. Eksperymenty te zostały przeprowadzone w podłożu LB, a nie w podłożu z glukozą. Obecność glukozy hamuje wychwyt AI-2 i aktywność promotora lsr39 , a wykorzystanie komórek CT104 mogłoby być potencjalnie ograniczone do pożywek bez glukozy (patrz Suplementary Fig. 3 dla schematu szlaku AI-2 QS). Opierając się na wiedzy o systemie AI-2 QS, podjęliśmy próbę stworzenia szczepu zdolnego do wychwytu AI-2 i aktywacji promotora lsr w podłożach zawierających glukozę. W ten sposób nasze wyniki mogłyby być bardziej ogólnie stosowane. Wcześniej wykazaliśmy, że HPr (kodowany przez ptsH) oddziałuje z LsrK, hamując aktywność kinazy LsrK, oraz że mutanty ptsH są zdolne do wychwytu AI-2 nawet w podłożach zawierających glukozę35. W związku z tym, postawiliśmy hipotezę, że użycie PH04 (ΔptsH ΔluxS) jako szczepu gospodarza pozwoli na produkcję AI-2 w oparciu o AI-1 w podłożach zawierających glukozę. Testowaliśmy komórki translatora używając obu szczepów gospodarza w podłożach LB i M9 z glukozą i bez AI-2. Poziom produkowanej AI-1 zależał od dodatku AI-2, ale także od szczepu gospodarza i podłoża (Rys. 4b). Oba szczepy produkowały AI-1, gdy komórki dodawano do pożywki LB z AI-2. Zgodnie z oczekiwaniami, w podłożu M9, użycie szczepu gospodarza CT104 powodowało małą lub nieistotną zmianę aktywności AI-1, gdy porównywano hodowle z i bez AI-2. Co ważne, komórki translatora PH04 wykazywały jednak produkcję AI-1 aktywowaną przez AI-2 w podłożu M9 + glukoza. W ten sposób opracowany system może być stosowany w podłożach zawierających glukozę.

Charakterystyka komórek translatorowych PH04

Komórki translatorowe PH04 pobierają cząsteczkę sygnałową AI-2, transdukują sygnał poprzez aktywację ekspresji LasI oraz syntetyzują i wydzielają AI-1. Pożądana produkcja AI-1 jest więc funkcją wejścia AI-2. Scharakteryzowaliśmy sygnalizowaną przez AI-2 produkcję AI-1 w szczepie translatorowym PH04 w czasie i dla zakresu biologicznie istotnych stężeń AI-2. Stwierdzono, że szybkość produkcji AI-1 przez komórki translatora PH04 jest zależna od dawki AI-2 (Rys. 5a). Zauważamy, że w tych i podobnych warunkach, AI-2 jest w większości zużywana w ciągu 4 h (Rys. 5b). Dodanie AI-2 lub wytwarzanie AI-1 w oparciu o AI-2 w tych hodowlach wsadowych nie spowodowało obserwowalnego zmniejszenia wzrostu komórek (Rys. 5c). Następnie scharakteryzowaliśmy tempo produkcji AI-1 w przeliczeniu na komórkę w czasie dla każdego badanego stężenia AI-2, wykreślając funkcję logistyczną dla danych AI-1, wyznaczając pochodną tego równania w czasie i dzieląc pochodną przez gęstość komórek w czasie (Tabela uzupełniająca 1), uzyskując zależne od czasu specyficzne tempo produkcji. Otrzymane w ten sposób wykresy (Rys. 5d) pokazują szacowaną szybkość produkcji AI-1 na komórkę jako funkcję dodanej AI-2 i czasu od dodania AI-2. Jak zostanie pokazane później, zgadza się to z podstawową obserwacją, którą zaobserwowaliśmy, że trajektoria ekspresji genów w odpowiedzi na początkową wskazówkę jest dość solidna21,38,40.

Następnie sprawdzono wpływ AI-1 produkowanego przez komórki translatora PH04 na tempo wzrostu komórek kontrolera reagujących na AI-1. To znaczy, komórki reagujące na wzrost były dodawane do CM zawierającego AI-1 z komórek translatora, które były wystawione na działanie różnych poziomów AI-2 i hodowane przez ~3 h (Supplementary Fig. 4a). Poza tym, co pokazano na Rys. 5, gdzie AI-1 jest generowana z bezpośredniej ekspozycji na AI-2, eksperyment ten pokazuje, że translacja komórek AI-2 na AI-1 może być przeprowadzona z odpowiednią ekspresją i dynamiką hodowli komórkowej, tak by wpływać na tempo wzrostu drugiej populacji (Supplementary Fig. 4b). Zauważamy również, że dynamiczne tempo wzrostu komórek regulatorowych zmniejszyło się w czasie w ciągu następnych 3 h. Ta obserwacja stała się bardziej dramatyczna w późniejszych eksperymentach ko-kulturowych.

Autonomiczna regulacja składu ko-kultury

Następnie dodaliśmy komórki translatora (określane jako Populacja A) i komórki regulatorowe reagujące na AI-1 (Populacja B) do roztworów o różnych początkowych stężeniach AI-2. W ko-kulturach komórek translatorów i komórek regulatorowych, komórki translatorów autonomicznie regulowały skład konsorcjów w oparciu o początkowy poziom AI-2. Na Suplementarnym Rys. 5, współkultury z podwyższonym początkowym poziomem AI-2 powodowały wzrost AI-1 (Suplementarny Rys. 5b) i odpowiadający mu wzrost względnej liczebności populacji B (Suplementarny Rys. 5a). Wyniki te zademonstrowały koncepcję autonomicznej kontroli populacji konsorcjów za pośrednictwem sygnału. Co ważne, szacunki tempa wzrostu dla Populacji A i Populacji B zgadzały się z oczekiwanymi wartościami tempa wzrostu mierzonymi podczas eksperymentów z monokulturami (Supplementary Fig. 5c).

Następnie, po wykazaniu, że komórki translatorowe mogą regulować skład konsorcjów w oparciu o ekspozycję na AI-2, opracowaliśmy model matematyczny w celu scharakteryzowania dynamiki systemu. W ten sposób, można przewidzieć zachowanie ko-kultury biorąc pod uwagę specyficzne warunki początkowe, projekty szybkości wzrostu, etc., w celu określenia parametrów wymaganych do osiągnięcia pożądanych wyników. Ten konceptualnie prosty model matematyczny został stworzony do przewidywania zachowania ko-kultury przy użyciu danych z poszczególnych szczepów. Model składa się z czterech równań różniczkowych zwyczajnych, po jednym dla każdej gęstości populacji, stężenia substratu i stężenia AI-1 (tabele uzupełniające 2 i 3). Do modelowania wzrostu komórek i stężenia substratu wykorzystano kinetykę wzrostu Monoda ze stałym współczynnikiem wydajności, z dodatkowymi funkcjami uwzględniającymi produkcję i/lub działanie cząsteczek QS. AI-1 produkowany przez populację A jest oparty zarówno na poziomie ekspozycji na AI-2, jak i na czasie (fAI1). W poprzedniej pracy38 stwierdziliśmy, że zależne od czasu trajektorie zachowania komórek były konsekwencją początkowej ekspozycji na autoinduktor, tak więc zależne od czasu funkcje produkcji AI-1 byłyby tutaj prawdopodobne. Tempo wzrostu populacji B zostało sformułowane w oparciu o dominujący poziom AI-1 (fHPr). Maksymalne specyficzne tempo wzrostu zmierzono na podstawie danych doświadczalnych, wydajność oszacowano na podstawie doświadczalnie obserwowanej gęstości fazy stacjonarnej i znanych początkowych stężeń substratów, a wartości K1 i K2 wybrano na podstawie wartości literaturowych dla glukozy. Do rozwiązania układu ODE użyto solvera ode45 programu MATLAB (wersja R2016a). Model ten może być użyty do pokazania, jak przewiduje się zmianę populacji współkultury w czasie, biorąc pod uwagę te proste fenomenologiczne równania szybkości i najlepiej dopasowane stałe. Jak zauważono, stanowi to podstawę do określenia czy można w ogóle przewidzieć ewolucję współkultury w ograniczonym czasie dostępnym w hodowli wsadowej. Co ważne, nasze wyniki z monokultur są używane do symulowania wyników eksperymentalnych ze współkultur.

To znaczy, że następnie oceniliśmy autonomicznie zaprogramowaną kontrolę współkultury poprzez przewidywania modelu. Kokultury populacji A i B były umieszczane razem dla różnych początkowych populacji komórek, a następnie dodawane do pożywki z przepisanymi poziomami AI-2 w celu wprawienia w ruch trajektorii populacji. W naszym systemie, początkowy skład jest wybierany w oparciu o proporcje komórek dostarczanych w ko-kulturze, a następnie skład kultury jest autonomicznie dostosowywany w czasie w oparciu o poziom AI-2 w podłożu. Porównaliśmy wyniki z naszym modelem. Na Rys. 6, skład ko-kultury i poziom AI-1 po 5 h jest pokazany dla różnych warunków, włączając w to różne początkowe proporcje A:B i poziom AI-2. W testach tych zastosowaliśmy jedną początkową gęstość komórek populacji. Co ważne, stwierdziliśmy, że nasz model dobrze przewidywał wyniki eksperymentalne zarówno dla poziomu AI-1 jak i składu ko-kultury. Zauważyliśmy również, że model może być użyty do wyboru warunków początkowych, które dają pożądany wynik. Na przykład, aby uzyskać Populację B o względnej gęstości komórek 55% po 5 h, można rozpocząć współkulturę z początkowym stosunkiem A:B 60:40 i stężeniem AI-2 40 µM. Inne scenariusze zostały przetestowane i zwalidowane, jak pokazano na rysunku. Wyniki te wyraźnie pokazują, że początkowe warunki składu komórek (np. stosunek A:B) i ekspozycja na różne poziomy AI-2 wpływają na trajektorię populacji w ko-kulturze. Równie ważne jest jednak to, że ortogonalna cząsteczka sygnałowa, AI-1, zachowywała się zgodnie z modelem. Przewidujemy, że przez rozszerzenie, włączenie tego i innych sygnałów translatorowych umożliwi dalsze, zróżnicowane lub bardziej skomplikowane konsorcja do zaprojektowania i/lub kontrolowania.

To znaczy, przetestowaliśmy system kontrolera ko-kultury poprzez ekspozycję na stężenie AI-2, 80 µM, które było wyższe niż stężenia AI-2 użyte do scharakteryzowania komórek translatora, i dla którego nie mieliśmy modelu. Użyliśmy wyników ko-kultury (Rys. 6) do oszacowania zachowania komórek translatorowych w monokulturze przy tym stężeniu AI-2. Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty z monokulturą przez dodanie 80 µM AI-2 do komórek translatora i wykazaliśmy, że byliśmy w stanie przewidzieć zachowanie w monokulturze używając danych z ko-kultury i modelu. Uzupełniający Rys. 6a pokazuje tempo produkcji AI-1 przewidywane na podstawie danych z ko-kultury i modelu (linia) oraz rzeczywiste tempo produkcji AI-1 podczas eksperymentu monokulturowego (punkty danych). Uzupełniające Rys. 6b pokazuje przewidywane poziomy AI-1 w monokulturze w czasie w porównaniu z rzeczywistymi zmierzonymi poziomami AI-1. Przewidywany poziom AI-1 został określony przy użyciu modelu, wprowadzając szacowaną szybkość produkcji AI-1 i początkową gęstość komórek monokultury.

Na koniec, przetestowaliśmy nasz system ko-kultury w bardziej wydłużonym okresie czasu, używając powtarzanego karmienia wsadowego z wielokrotnym dodawaniem AI-2 (Rys. 7). Tutaj, naszym celem było rozszerzenie trajektorii populacji poza tę uzyskaną przez zmianę początkowego składu i ekspozycji na stały poziom AI-2 w prostej hodowli wsadowej. W ten sposób testowaliśmy odporność schematu kontroli. Na przykład, na Rys. 6, dla hodowli początkowo na poziomie ~40% populacji B, stwierdziliśmy, że możemy osiągnąć poziom populacji B zbliżony do 60% i to tylko poprzez ekspozycję na wysoki poziom (>80 μM) AI-2. Testując system powtarzanych partii, myśleliśmy, że możemy doprowadzić populację B do ponad 80% przez proste ponowne zawieszenie i przedłużenie systemu w czasie. Dodawaliśmy naszą ko-kulturę do pożywki z różnymi poziomami AI-2 i co 3 godziny ponownie zawieszaliśmy komórki w świeżej pożywce z dodatkowym AI-2. Bezpośrednio przed każdą resuspensją pobierane były próbki do analizy stężenia AI-1 i składu hodowli komórkowej (Rys. 7a, b). Mierzono również gęstość komórek i aktywność AI-2 (Supplementary Fig. 7). Stwierdziliśmy, że w tym bardziej złożonym układzie doświadczalnym, system generalnie działał zgodnie z założeniami. Stwierdziliśmy, że poprzez ekspozycję na mniejsze ilości AI-2 (20 i 40 μM), mogliśmy osiągnąć prawie 80% populacji B. Podczas tego testu stwierdziliśmy jednak, że nasze wyniki eksperymentalne odbiegały od wyników przewidywanych przez nasz model matematyczny. Przyjrzeliśmy się dokładniej produkowanej AI-1 i tempu wzrostu hodowli podczas każdego odcinka 3 h, by zrozumieć dynamikę hodowli w oparciu o zaobserwowane rozbieżności z prostym modelem. Na przykład, AI-1 produkowana podczas drugiego i trzeciego 3-godzinnego cyklu była wyższa niż przewidywana przez model. Z perspektywy czasu miało to sens, ponieważ komórki, po pierwszym cyklu wsadowym, już wyprodukowały LasI (który syntetyzuje AI-1), a dodatkowe AI-2 prawdopodobnie indukowało dalszą produkcję LasI (nie dołączyliśmy znacznika degradacji LasI, więc jego utrzymanie powinno być przewidywane). Następnie dostosowaliśmy model tak, by szybkość produkcji AI-1 na początku każdej kolejnej resuspensji w nowym podłożu była taka sama jak na końcu poprzedniego cyklu (Rys. 7c, linie ciągłe). Włączenie tych nowych funkcji dla produkcji AI-1 do modelu dało wartości dla AI-1, które ściśle pasowały do danych eksperymentalnych AI-1 (Rys. 7a, model w liniach ciągłych). Podobnie, oszacowaliśmy tempo wzrostu komórek kontrolera (patrz Supplementary Note 1) i stwierdziliśmy, że tempo wzrostu w połączeniu ze stężeniami AI-1 nie pasowało do naszej wcześniejszej funkcji fAI1 (Rys. 7d). Zwracamy uwagę, że do obliczenia tempa wzrostu komórek kontrolera założyliśmy, że tempo wzrostu komórek translatora pozostało stałe, chociaż mogły one nieco zmaleć w wyniku wielokrotnego dodawania AI-2. Podczas gdy tempo wzrostu kontrolera wydawało się początkowo wzrastać jako funkcja AI-1, z kolejnymi powtórnymi zawiesinami w świeżej pożywce ogólne tempo wzrostu spadało. Wcześniej zauważyliśmy dynamiczny spadek tempa wzrostu przy nadekspresji HPr i LasI (Rys. 4 i 5 Suplementu). Tutaj podejrzewamy, że przyczyną spadku tempa wzrostu w późniejszych cyklach mogło być albo obciążenie metaboliczne komórek spowodowane wielokrotną ekspozycją na wysokie poziomy AI-1, albo obniżone poziomy substratów lub składników odżywczych. Co ważne, dostosowując nasz model tak, by wpływ AI-1 na tempo wzrostu malał z czasem (patrz Supplementary Note 2), byliśmy w stanie dopasować nasze dane doświadczalne (Rys. 7b, dostosowany model w liniach ciągłych) bez dodawania złożoności modelu.

Podsumowując, nasz system ko-kultury reagował zgodnie z projektem, niezależnie od tego czy był umieszczony w podłożu bez AI-2 czy z wysokim poziomem AI-2. Co więcej, nasze wyniki pokazały możliwe do kontrolowania gęstości populacji, które obejmowały od 40 do 80% komórek kontrolera. Również porównanie z naszym oryginalnym modelem dało wgląd w to, jak system zachowywał się w tym bardziej złożonym układzie eksperymentalnym; komórki tłumacza wydawały się produkować wyższe poziomy AI-1 w czasie, podczas gdy komórki kontrolera wydawały się mieć zmniejszone regulowane przez AI-1 zmiany w tempie wzrostu w czasie.

Wreszcie, model może stanowić podstawę do zbadania in silico, jak strategie zastosowane tutaj dla autonomicznie regulowanych kultur (oznaczone przez regulowane sygnałem tempo wzrostu i natywną sygnalizację komórka-komórka) mogłyby być rozszerzone na inne systemy, w tym regulowane przez użytkownika lub programowalne systemy, które mogłyby być dynamicznie kontrolowane. Na przykład, hodowle chemostatyczne różnią się od obecnego systemu autonomicznego tym, że ich wyniki są kierowane przez dane wejściowe określone przez użytkownika, takie jak stopień rozcieńczenia. W pierwszej kolejności przeprowadziliśmy symulacje współkultur hodowanych w chemostatach poprzez dodanie standardowych warunków przepływu do modelu wsadowego (Supplementary Fig. 8, Supplementary Tables 4 i 5). W niektórych przypadkach stwierdziliśmy, że szybkość rozcieńczania definiuje skład kultury w stanie ustalonym, który z kolei może być następnie „dostrajany” w zakresie ograniczonym przez szybkość rozcieńczania. Dostrojenie” to może być osiągnięte przez zewnętrzną modulację sygnalizacji komórka-komórka, na przykład, przez egzogenne dodanie cząsteczek sygnałowych. Te przypadki ilustrują jak współdziałanie naszego autonomicznego systemu z innymi systemami kontrolowanymi przez użytkownika może prowadzić do bardziej złożonych trajektorii populacji. Nasze wyniki symulacji służą jako ramy koncepcyjne dla kontrolowania składu konsorcjów w bardziej złożonych, sterowanych przez użytkownika systemach. Dalsze omówienie symulacji chemostatycznej znajduje się w Dodatkowej Nocie 3.

.