D Complex Formation
Powstawanie protrombinazy definiuje ważne wydarzenie modulujące katalitycznie, ponieważ kompletny kompleks jest 300 000 razy bardziej wydajny niż wolny czynnik Xa działający na protrombinę w roztworze.24,72 Implikacją tego znaczącego wzrostu szybkości jest to, że jakakolwiek dysocjacja składników z kompleksu znacząco i drastycznie zmniejsza aktywność enzymu. Brak powierzchni błony w kompletnym katalizatorze powoduje 1000-krotny spadek wydajności katalitycznej, podczas gdy usunięcie czynnika Va z kompleksu powoduje 10 000-krotny spadek szybkości generowania trombiny.24 Powierzchnia błony jest obowiązkowo wymagana, ponieważ, chociaż przyczynia się w niewielkim stopniu do wewnętrznej szybkości katalizy, zapewnia środowisko, w którym zarówno kompleks czynnik Va-faktor Xa, jak i substrat mogą się koncentrować.277 Wydaje się, że protrombina koncentruje się na powierzchni błony płytki w dużej części poprzez mechanizmy pośredniczące receptorów opisane wcześniej. Czynnik Va, na mocy jego zdolności wiązania się z błoną, tworzy obowiązkową i o wysokim powinowactwie interakcję z czynnikiem Xa, ponieważ czynnik Xa nie będzie wiązał się z aktywowanymi płytkami krwi w przypadku braku czynnika Va. Koncentracja reagentów na powierzchni błony powoduje wysokie lokalne stężenia reagentów, które przekraczają samoistne Km reakcji i znacznie poprawiają wydajność katalityczną. Ponadto czynnik Va zwiększa szybkość obrotu reakcji w mechanizmie, który nie został jeszcze zracjonalizowany.278
Tworzenie kompleksów zapewnia również składnikom protrombinazy ochronę przed inhibitorami i/lub inaktywatorami. W przeciwieństwie do czynnika Xa wolnego w roztworze, czynnik Xa włączony do protrombinazy (tj. skompleksowany z czynnikiem Va związanym z błoną) jest chroniony przed inhibicją przez antytrombinę III i heparynę.72 Podobnie, czynnik Va włączony do protrombinazy jest chroniony przed proteolityczną inaktywacją przez aktywowane białko C109,110 – proces, który jest szczegółowo omówiony w następnej sekcji.
Wewnętrzna Xaza jest modulowana przez różne mechanizmy podobne do tych obserwowanych w przypadku protrombinazy. Tworzenie kompleksów powoduje około 2 × 107-krotne zwiększenie wydajności katalitycznej.217 Wiązanie czynników VIIIa i IXaβ z płytkami aktywowanymi trombiną powoduje 2500-krotne zmniejszenie Km dla aktywacji czynnika X i umożliwia czynnikowi VIIIa około 7500-krotne zwiększenie kcat. Antytrombina III nie może hamować czynnika IXaβ w obecności czynnika VIIIa i płytek krwi.279 Podobnie jak w przypadku czynnika Va, tworzenie kompleksów czynnika VIIIa z czynnikiem IXaβ moduluje jego aktywność. Dysocjacji podjednostki A2 z heterotrimeru czynnika VIIIa, która prowadzi do całkowitej utraty aktywności kofaktora, zapobiega jego asocjacja z czynnikiem IXaβ na powierzchni błony,280 podobnie jak jego inaktywacja przez APC.62,281
Ponieważ czynnik Va jest bezwzględnie wymagany do fizjologicznego tworzenia trombiny, znaczące różnice w aktywacji protrombiny mogą być osiągnięte poprzez proteolityczne, inaktywujące zmiany w kofaktorze katalizowane przez aktywowane białko C. Proteoliza i inaktywacja wymagają, aby czynnik Va był związany z płytkami krwi59,74 lub błoną.282 Wczesne badania wykazały, że inkubacja aktywowanego białka C z płytkami aktywowanymi trombiną spowodowała równoległe zmniejszenie wiązania czynnika Xa i aktywacji protrombiny, co sugeruje, że po rozszczepieniu przez aktywowane białko C czynnik Va nie wiąże czynnika Xa.283,284 Stąd aktywowane białko C-katalizowana inaktywacja czynnika Va ma dramatyczny wpływ na generowanie trombiny.
Ludzkie płytki krwi są w stanie promować i modulować aktywowane białko C-katalizowaną inaktywację czynnika Va pochodzącego z osocza i płytek krwi, chociaż te dwie pule kofaktorów nie są równoważnymi substratami w odniesieniu do inaktywacji. Trzy rozszczepienia w łańcuchu ciężkim cząsteczki ludzkiego czynnika Va są wymagane do skutecznej inaktywacji katalizowanej przez aktywowane białko C: rozszczepienie przy Arg506, a następnie rozszczepienia przy Arg306 i Arg679,282,285 Rozszczepienie przy Arg506 jest szybsze i poprzedza zależne od błony, inaktywujące rozszczepienie przy Arg306,282 Aktywowana trombiną, ludzka powierzchnia płytek krwi odgrywa ważną rolę w katalizowanej przez aktywowane białko C inaktywacji pochodzącego z płytek krwi czynnika Va i wariantu czynnika Va, czynnika VaLeiden.109,110 Czynnik VaLeiden powstaje w wyniku trombinowej aktywacji czynnika VLeiden, wariantu, w którym Arg506 został zastąpiony glutaminą, zasadniczo usuwając miejsce rozszczepienia aktywowanego białka C w pozycji 506.286 Dlatego osoby homozygotyczne (a w niektórych przypadkach heterozygotyczne) dla tej mutacji cierpią na słabą odpowiedź przeciwzakrzepową na aktywowane białko C i są narażone na zwiększone ryzyko zakrzepicy żylnej.287-Normalne i zmutowane kofaktory płytkowe są inaktywowane przez aktywowane białko C w niemal identycznym tempie; jednakże całkowita inaktywacja obu pochodzących z płytek kofaktorów nigdy nie jest osiągana,109,110 ponieważ pozostaje aż 50% pierwotnej aktywności. Wyniki te wyraźnie kontrastują z tym, co zaobserwowano w badaniach nad katalizowaną przez aktywowane białko C inaktywacją pochodzącego z osocza czynnika Va i czynnika VaLeiden na syntetycznych pęcherzykach fosfolipidowych.290-292 W tych badaniach zawsze obserwuje się całkowitą inaktywację kofaktorów, chociaż osoczowy czynnik VaLeiden jest inaktywowany znacznie wolniej niż normalny osoczowy czynnik Va. W badaniach nad płytkami krwi większa aktywność resztkowa zarówno płytkopochodnego czynnika Va, jak i czynnika VaLeiden utrzymuje się, gdy jako powierzchnię błony inaktywującej stosuje się płytki aktywowane trombiną, w przeciwieństwie do prawie całkowitej inaktywacji, gdy jako powierzchnię inaktywującą stosuje się syntetyczne pęcherzyki fosfolipidowe.110 W ten sposób aktywowane płytki krwi chronią płytkopochodne kofaktory przed inaktywacją katalizowaną przez aktywowane białko C.109,110
Aktywowane płytki krwi chronią również normalny osoczopochodny czynnik Va przed inaktywacją przez aktywowane białko C poprzez spowolnienie rozszczepienia przy Arg506.110 Jednak w przeciwieństwie do kofaktora pochodzącego z płytek krwi, osoczopochodny czynnik Va może być całkowicie inaktywowany przez aktywowane białko C, co sugeruje, że dwie różne pule kofaktorów (osocze vs. płytki krwi) są różnymi substratami dla APC.110 Badania te ponownie potwierdzają znaczenie zdarzeń wiążących w modulowaniu aktywności protrombinazy. Pokazują one również, że błony fosfolipidowe płytek krwi i syntetyczne nie są równoważnymi powierzchniami w regulacji tworzenia kompleksów enzymatycznych. Łącznie, badania te wskazują, że płytki krwi podtrzymują zdarzenia prokoagulacyjne przez zapewnienie powierzchni błony, która opóźnia inaktywację kofaktora i przez uwalnianie cząsteczki kofaktora, która wykazuje fenotyp odporny na aktywowane białko C.
Interesujące jest rozważenie, że w miejscach uszkodzenia tętnic, mutacja czynnika VLeiden może nie tak łatwo przewidzieć zakrzepicę tętniczą, ponieważ normalne i wariantowe kofaktory pochodzące z płytek krwi są równie odporne na aktywowane białko C na aktywowanej powierzchni płytki. W rzeczywistości, wykazana rola mutacji czynnika VLeiden w przewidywaniu zakrzepicy żylnej287-289 może odzwierciedlać udokumentowaną oporność kofaktora czynnika VaLeiden pochodzącego z osocza w porównaniu z normalnym, pochodzącym z osocza czynnikiem Va.290-292 Pula kofaktorów osocza może odgrywać bardziej znaczącą rolę w zakrzepicy żylnej z powodu braku znaczącego udziału płytek krwi. Z kolei w miejscu zakrzepu tętniczego kofaktor pochodzący z płytek krwi, w wyniku jego uwolnienia i aktywacji, może być obecny w stężeniu przekraczającym 600 razy stężenie kofaktora osoczowego.106
.