Czy cDNA jest jednoniciowe czy dwuniciowe? – (Feb/09/2006 )

Witam,
Zamieściłem moje pytanie gdzie indziej, ale nie otrzymałem odpowiedzi, chciałbym zamieścić je tutaj i, przepraszam, że wydaje się to głupie pytanie, ponieważ jestem naprawdę zdezorientowany !
Czytałem gdzieś rzecz, która wprawiła mnie w zakłopotanie na temat cDNA. Chciałbym wiedzieć, czy cDNA jest dwuniciowe czy jednoniciowe?
Wiem, że cDNA jest kopią mRNA przez odwrotną transkryptazę, więc teoretycznie byłoby jednoniciowe, prawda czy się mylę?
Dziękuję za odpowiedź

W większości przypadków, takich jak RT-PCR, 3′ lub 5′ RACE, po prostu używamy jednoniciowego cDNA (pierwsza nić cDNA), podczas gdy w przypadku przygotowywania cDNA do budowy biblioteki lub analizy RDA/SSH, która może wymagać dodatkowego kroku syntezy drugiej nici w celu wygenerowania dwuniciowego cDNA.

hi
musisz odróżnić 2 rzeczy :
cDNA w ogóle jest cząsteczką DNA odpowiadającą z grubsza seuqence mRNA. Tak więc jest to dwuniciowa cząsteczka zawarta w plazmidzie do ekspresji w większości przypadków.
RT PCR : cząsteczka mRNA jest odwrotnie transkrybowana w pojedynczą nić cDNA. Po tym punkcie RNaza eliminuje cząsteczkę mRNA i otrzymujemy jednoniciową cząsteczkę cDNA. Ponieważ następny krok jest dość klasycznym PCR, pojedyncza nić jest ok dla exp (i pierwszy krok, który odpowiada sysntezie odpowiadającej drugiej nici cząsteczki DNA przywraca prawdziwą cząsteczkę cDNA.
Aby mieć rację, cDNA jest dwuniciową cząsteczką, ale dla wygody, cDNA jest również używany do projektowania odwrotnie przepisanej cząsteczki RTPCR. Powinno być nazwane jako pół cDNA lub jednoniciowe cDNA.
cDNA jest nazwą skróconą.

podczas gdy w większości przypadków cDNA, skrót od komplementarnego DNA, jest definiowany jako jednoniciowa cząsteczka DNA z sekwencją nukleotydów, która jest komplementarna do cząsteczki RNA i jest syntetyzowana w laboratorium z mRNA przez odwrotną transkrypcję…

Czyli cDNA jest jednoniciowe dopóki nie zostanie przeprowadzona reakcja PCR ? Ok, w takim razie w jaki sposób polimeraza Taq DNA generuje drugą komplementarną nić z tylko jednej ? Kiedy dwa primery annealują do każdej strony tej samej nici, jak mogą wytworzyć drugą nić (nową komplementarną) ?

W PCR jeden primer wiąże się do jednoniciowego kawałka DNA (dlatego pierwszym krokiem jest zawsze dentyzacja w temperaturze 94C(lub wyższej), aby rozdzielić wszelkie dwuniciowe cząsteczki na pojedyncze nici. W przypadku pierwszoniciowego cDNA z reakcji RT tylko jeden primer wiąże się w pierwszej rundzie… Oznacza to, że pierwsza runda amplifikacji w RT-PCR nie jest logarytmiczna, po prostu syntetyzowana jest druga nić cDNA. W kolejnych rundach (od rundy 2 do rundy n) występuje logrytmiczna amplifikacja, ponieważ zarówno startery do przodu, jak i do tyłu wiążą się do zdenaturowanego dwuniciowego szablonu.
W pierwszej rundzie, myślę, że to primer forward się wiąże… Myślę, że to dlatego, że mRNA=forward strand w genomie i pierwszej nici cDNA=uzupełnienie mRNA (lub jest taki sam jak reverse strand w genomie)
Ktoś sprawdzić moją logikę tutaj, jestem mylące siebie… jest to, że prawo, że mRNA jest uzupełnienie reverse strand genomowego DNA?
ie: sekwencja mRNA=kreska forward=sekwencja 5′-3′ w gDNA (tylko z U nie T)????
HTH

Dziękuję za wszystko, To jest bardziej jasne dla mnie teraz.

Myślę, że tak, tak, dopóki nie napotka się intronu, prawda ?
Możemy sprawdzić dowolną znaną sekwencję mRNA w NCBI, odzyskać genomowe trafienie i porównać sekwencje, żeby zobaczyć, czy to prawda, czy nie.

Yup to prawda, musiałbyś pominąć introny
Brzmi jak dobry sposób na przetestowanie, spróbuję później, jeśli będę miał okazję i dam ci znać… im więcej o tym myślę, sekwencja mRNA=sekwencja forward strand musi być w porządku chociaż…
Dzięki!