Elżbieta poślubiła Filipa II Hiszpańskiego, syna Karola V, Świętego Cesarza Rzymskiego, i Izabeli Portugalskiej w 1559 roku. Pierwotnie ślub odbył się przez pełnomocnika w Notre Dame (książę Alby zastępował Filipa) przed opuszczeniem Francji, ale właściwa ceremonia miała miejsce w Guadalajarze, w Hiszpanii, po jej przybyciu. Małżeństwo było wynikiem pokoju w Cateau Cambrésis (1559). Jego druga żona, Maria I Angielska, niedawno zmarła, przez co Elżbieta de Valois stała się trzecią żoną Filipa.
Na swoim ślubie poznała malarza Sofonisba Anguissola oraz Anę de Mendoza, z którą mieszkała do końca życia. Filip II wyznaczył Anguissolę na damę dworu i nadwornego malarza swojej królowej. Pod jego okiem Elżbieta doskonaliła swoje amatorskie umiejętności malarskie. Anguissola miała również wpływ na twórczość artystyczną jej dzieci, Izabeli Klary Eugenii i Cateriny Michaeli, które w tym czasie przebywały na dworze.
Filip był całkowicie oczarowany swoją 14-letnią narzeczoną i do 1564 roku porzucił swoje niewierności. Mimo znacznej różnicy wieku Elżbieta również była zadowolona ze swego męża (w listach do matki twierdziła, że ma szczęście, iż poślubiła tak czarującego księcia). Filip lubił organizować turnieje rycerskie, aby zabawiać żonę. Elżbieta była damą dworu hiszpańskiego dla trzech młodych książąt: Carlosa, księcia Asturii, Jana Austriaka (nieślubnego syna Karola V) i Aleksandra Farnese, księcia Parmy (syna nieślubnej córki Karola V, Małgorzaty).
Elżbieta była pierwotnie zaręczona z synem Filipa, Carlosem, księciem Asturii, ale komplikacje polityczne nieoczekiwanie wymusiły zamiast tego małżeństwo z Filipem. Jej stosunki z cierpiącym na problemy pasierbem Carlosem były ciepłe i przyjazne. Mimo doniesień o jego coraz bardziej dziwacznym zachowaniu, Carlos zawsze był dla Elżbiety miły i łagodny. Kiedy w końcu Filip musiał go zamknąć (co wkrótce doprowadziło do śmierci księcia), Elżbieta płakała całymi dniami.
Filip był bardzo przywiązany do Elżbiety, pozostając u jej boku nawet wtedy, gdy była chora na ospę. Pierwsza ciąża Elżbiety w 1560 r. zakończyła się urodzeniem martwego syna, a w 1564 r. poronieniem bliźniaczek. Następnie 12 sierpnia 1566 roku urodziła infantkę Izabelę Klarę Eugenię, a 10 października 1567 roku młodszą siostrę Izabeli, Katarzynę Michelle. Filip i Elżbieta byli bardzo zżyci z obiema córkami, kupując im dżemy, lalki, zabawki i wiele innych rzeczy. Mówi się, że „oboje cieszyli się z narodzin Izabeli tak, jakby to były narodziny syna”. 3 października 1568 roku Elżbieta ponownie poroniła i zmarła tego samego dnia, razem z nowo narodzoną córeczką.
Po śmierci Elżbiety Katarzyna Medycejska zaproponowała swoją młodszą córkę Małgorzatę jako narzeczoną dla Filipa. Filip odrzucił tę ofertę.