FLAG-tag

FLAG-tag, lub oktapeptyd FLAG, lub epitop FLAG, jest polipeptydowym znacznikiem białkowym, który może być dodany do białka przy użyciu technologii rekombinacji DNA, posiadającym motyw sekwencji DYKDDDDK (gdzie D=kwas asparaginowy, Y=tyrozyna i K=lizyna). Jest to jeden z najbardziej specyficznych znaczników i jest to sztuczny antygen, do którego opracowano specyficzne przeciwciała monoklonalne o wysokim powinowactwie, dzięki czemu może być stosowany do oczyszczania białek metodą chromatografii powinowactwa, a także może być wykorzystywany do lokalizacji białek w żywych komórkach. Została ona wykorzystana do oddzielenia rekombinowanego, nadekspresyjnego białka od białka typu dzikiego, wyrażonego przez organizm gospodarza. Może być również stosowana do izolacji kompleksów białkowych z wieloma podjednostkami, ponieważ jej łagodna procedura oczyszczania nie powoduje zaburzeń takich kompleksów. Została ona wykorzystana do uzyskania białek o wystarczającej czystości i jakości do przeprowadzenia oznaczenia struktury 3D metodą krystalografii rentgenowskiej.

Tag FLAG może być użyty w wielu różnych badaniach, które wymagają rozpoznania przez przeciwciało. Jeśli nie ma przeciwciała przeciwko danemu białku, dodanie znacznika FLAG do białka pozwala na badanie białka za pomocą przeciwciała przeciwko sekwencji FLAG. Przykładem są badania lokalizacji komórkowej metodą immunofluorescencji, immunoprecypitacji lub wykrywania metodą elektroforezy białek SDS PAGE i Western blotting.

Sekwencja peptydowa znacznika FLAG od N-końca do C-końca to: DYKDDDDK (1012 Da). Dodatkowo może być stosowany w tandemie, powszechnie jako peptyd 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (z końcowym znacznikiem kodującym miejsce rozszczepienia enterokinazy). Można je łączyć z C-końcem lub N-końcem białka lub umieszczać wewnątrz białka. Niektóre dostępne w handlu przeciwciała (np. M1/4E11) rozpoznają epitop tylko wtedy, gdy jest on obecny na N-końcu. Jednakże, inne dostępne przeciwciała (np. M2) są niewrażliwe na położenie. Reszta tyrozynowa w znaczniku FLAG może być sulfatowana, co może wpływać na rozpoznawanie epitopu FLAG przez przeciwciała. Znacznik FLAG może być stosowany w połączeniu z innymi znacznikami powinowactwa, na przykład znacznikiem polihistydynowym (His-tag), HA-tag lub myc-tag.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.