Kopalna struktura tkanki miękkiej
Małe płaty tkanki (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d i Supplementary Figs. 2-6) są ściśle związane z kopalnymi piórami (tzn, zwykle w odległości 500 µm od węglowych pozostałości piór, Supplementary Fig. 2e, g, j, k, o, s, t). Plamy te należą bezsprzecznie do tkanki kopalnej i nie odzwierciedlają zanieczyszczenia powierzchni materiałem współczesnym podczas przygotowywania próbki, gdyż zachowane są w fosforanie wapnia (patrz 'Taphonomia’, poniżej); ponadto, kilka próbek wykazuje krawędzie, które częściowo pokrywają się z otaczającą je macierzą. Tkanki nie przylgnęły więc po prostu do powierzchni próbki w wyniku zanieczyszczenia cząsteczkami powietrza w laboratorium.
Zafosfatyzowane tkanki miękkie u nie-owadzich dinozaurów maniraptorowych i ptaka bazalnego. a-h Obrazy elektronowe rozpraszania wstecznego tkanek u Confuciusornis (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosaurus (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosaurus (IVPP V 12811; c, h) i Microraptor (IVPP V 17972A; d). a-d Małe płaty tkanki o nieregularnym kształcie. e Szczegół powierzchni tkanki ukazujący teksturę wieloboczną. f Przekrój pionowy przez tkankę miękką wykonany zogniskowaną wiązką jonów, ukazujący wewnętrzną warstwę włóknistą oddzielającą dwie bezstrukturalne warstwy. g, h Złamany przekrój skośny przez tkanki miękkie, ukazujący warstwy widoczne w f
Płaty tkanki mają zwykle grubość 3-6 µm i są płaskie (ryc. 1a-e). Przekroje poprzeczne i powierzchnie pęknięte wykazują wewnętrzną warstwę włóknistą (o grubości 1,0-1,2 µm) pomiędzy dwiema cieńszymi warstwami bezstrukturalnymi (o grubości 0,2-0,5 µm) (ryc. 1f-h). Zewnętrzna powierzchnia warstwy bezstrukturalnej jest gładka i może wykazywać subtelną teksturę poligonalną zdefiniowaną przez wielokąty o szerokości 10-15 µm (Ryc. 1e, h).
W warstwie włóknistej również widoczne są wielokąty (Ryc. 1f, h i 2a-e oraz Ryc. 6 uzupełniająca), które zawierają układy gęsto upakowanych włókien o szerokości 0,1-0,5 µm (Ryc. 2f-i i Ryc. 5f uzupełniająca). Dobrze zachowane włókna wykazują helikoidalne skręcenie (ryc. 2h, i). Włókna w częściach brzeżnych każdego wielokąta mają szerokość 0,1-0,3 µm i są zorientowane równolegle do powierzchni tkanki; włókna we wnętrzu każdego wielokąta mają szerokość 0,3-0,5 µm i są zwykle prostopadłe do powierzchni tkanki (ryc. 2b, h i Supplementary Fig. S6d). W brzeżnych 1-2 µm każdego wielokąta włókna są zwykle ortogonalne do bocznego brzegu wielokąta i kończą się na lub łączą sąsiednie wielokąty (ryc. 2f, g i ryc. 6e). Wielokąty są zazwyczaj równowymiarowe, ale są lokalnie wydłużone i wzajemnie wyrównane, gdzie grube włókna w każdym wielokącie są sub-paralelne do powierzchni tkanki, a cienkie włókna, równoległe do brzegu wielokąta (ryc. 2j, k i uzupełniające ryc. 6g-l). Niektóre poligony wykazują centralne wgłębienie (Fig. 2c-e i Supplementary Fig. 6a-c), w którym grube włókna mogą otaczać kulistą strukturę o szerokości 1-2 µm (Fig. 2e).
Ultrastruktura tkanek miękkich u Confuciusornis (IVPP V 13171). a, b Mikrografy elektronowe rozpraszania wstecznego; wszystkie pozostałe obrazy są mikrografami elektronów wtórnych. a, b Ściśle upakowane wielokąty. c Szczegóły wielokątów ukazujące zawartość włóknistą, z rysunkiem interpretacyjnym d. e-g Wielobok (e) ze szczegółami wskazanych regionów ukazujących tonofibryle mostkujące (f) i przylegające do (g) połączeń między wielokątami. h, i Spiralne zwijanie się tonofibryli. h Skośny widok wielokąta z centralnymi tonofibrylami zorientowanymi prostopadle do powierzchni wielokąta. j, k Polygony wykazujące deformację przypominającą rozciąganie
Kamienne korneocyty
Tekstura tych kopalnych tkanek różni się od tekstury muszli konchostracjan i rybich łusek z osadu gospodarza, muszli współczesnego Mytilus, współczesnych i kopalnych rachis piór oraz współczesnego naskórka gadów (Supplementary Fig. 7a-n). Wydłużona geometria niektórych wielokątów (Fig. 2j, k oraz Supplementary Fig. 6g, l) sugeruje sprężyste odkształcenie niebiomineralizowanej tkanki pod wpływem naprężeń mechanicznych. Na podstawie rozmiarów, geometrii i budowy wewnętrznej wieloboczne struktury interpretowane są jako korneocyty (keratynocyty naskórka). U współczesnych amniotów są to wielościany – spłaszczone komórki (1-3 µm × ok. 15 µm) wypełnione tonofibrylami keratyny, lipidami i białkami macierzy18,19,20 (ryc. 3a, b i ryc. 2u-x, 8, 9). Zewnętrzna, pozbawiona struktury warstwa materiału kopalnego odpowiada marginesowi komórki; jest ona grubsza niż oryginalny wzorzec biologiczny, tj. rogowa otoczka komórkowa i/lub błona komórkowa, ale nie jest to nieoczekiwane, odzwierciedlając diagenetyczne zarastanie przez fosforan wapnia (patrz 'Taphonomia’). Włókna w kopalnych korneocytach zidentyfikowano jako zmineralizowane tonofibryle: proste, nierozgałęziające się wiązki superzwiniętych włókien α-keratyny o szerokości 0,25-1 µm18,21, które stanowią główny składnik cytoszkieletu korneocytów22 i są otoczone amorficznymi białkami cytoszkieletu22. W skamieniałościach cienkie tonofibryle często przylegają do komórek sąsiednich (ryc. 2g i ryc. 6e), ale lokalnie mogą stanowić pomost pomiędzy sąsiadującymi komórkami (ryc. 2f). Przypomina to desmosomy, regiony silnego połączenia międzykomórkowego między współczesnymi korneocytami23. Centralne kuliste struktury w obrębie kopalnych korneocytów przypominają martwe jądra komórkowe24, podobnie jak w korneocytach wymarłych ptaków (ale nie wymarłych gadów i ssaków)24 (Supplementary Fig. 8). Położenie tych piknotycznych jąder jest często wskazywane przez wgłębienia na powierzchni korneocytów u ptaków wymarłych24 (Fig. 3b); niektóre komórki kopalne wykazują podobne wgłębienia (Fig. 2c i Supplementary Fig. 6a-c).
Korneocyty u ptaków wymarłych. a-d Skaningowe mikrografy elektronowe zrzuconej skóry u wymarłej zeberki (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d). a Korneocyty definiujące wieloboczną teksturę. b Centralne wgłębienie (strzałka) oznacza pozycję jądra piknotycznego. c, d Płatki zrzuconej skóry wplecione w pióra
Tafonomia
Keratyna jest stosunkowo rekurencyjną biomolekułą ze względu na silnie usieciowaną strukturę parakrystaliczną i hydrofobowy, niepolarny charakter23. Replikacja kopalnych korneocytów w fosforanie wapnia jest więc nieco nieoczekiwana, gdyż proces ten wymaga zwykle stromych gradientów geochemicznych charakterystycznych dla wczesnego rozpadu25 i zwykle dotyczy tkanek podatnych na rozpad, takich jak mięśnie26 i tkanki trawienne27. Oporne tkanki, takie jak kolagen skóry właściwej, mogą jednak być replikowane w fosforanie wapnia, jeśli zawierają nieodłączne źródło wapnia, a w szczególności jony fosforanowe, które są uwalniane podczas rozpadu28. Korneocyty zawierają źródła obu tych jonów. Podczas terminalnego różnicowania, wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia wzrasta29 , a łańcuchy α-keratyny są intensywnie fosforylowane23. Ponadto granulki lipidowe korneocytów30 są bogate w fosfor i fosforan31. Te związki chemiczne zostałyby uwolnione podczas degradacji granulek i wytrąciłyby się na pozostałym substracie organicznym, tj. na tonofibrylach.
U ssaków żyjących na wolności, gęsto upakowane układy tonofibryli wymagają obfitych białek macierzy międzykeratynowej dla zapewnienia stabilności32. Białka te jednak nie są widoczne w skamieniałościach. Nie jest to nieoczekiwane, ponieważ białka te są rzadkie w istniejących korneocytach ptaków33 i, co istotne, występują jako rozproszone monomery34 i miałyby mniejszy potencjał konserwacyjny niż silnie usieciowane i spolimeryzowane wiązki keratyny w tonofibrylach. Zewnętrzna, pozbawiona struktury warstwa kopalnych korneocytów jest grubsza niż prawdopodobny biologiczny wzorzec (wzorce), tj. otoczka rogowa (warstwa lipidów, keratyny i innych białek o grubości do 100 nm, która zastępuje błonę komórkową podczas różnicowania końcowego34 ) i/lub błona komórkowa. Może to odzwierciedlać lokalne mikrośrodowisko sprzyjające wytrącaniu się fosforanu wapnia: podczas różnicowania końcowego na obrzeżach rozwijających się korneocytów gromadzą się granulki keratohialiny, białka o wysokim powinowactwie do jonów wapnia3536. Grubość zewnętrznej stałej warstwy fosforanu wapnia w skamieniałościach oraz stopniowe przejście od niej do wewnętrznej warstwy włóknistej sugeruje, że wytrącanie fosforanu postępowało od brzegów w kierunku wnętrza korneocytów. W tym scenariuszu dostępność fosforanu w strefach brzeżnych komórek przekroczyłaby ilość potrzebną do odtworzenia tonofibryli. Dodatkowy fosforan wytrącałby się w postaci fosforanu wapnia w przestrzeniach międzywęzłowych między tonofibrylami, postępując do wewnątrz od wewnętrznej strony marginesu komórki.
Zrzucanie skóry u opierzonych dinozaurów i wczesnych ptaków
U żyjących płazów warstwa rogowa naskórka ma zwykle grubość 5-20 komórek (ale grubość różni się w zależności od gatunku i miejsca na ciele38). Płaty kopalnych korneocytów mają jednak grubość jednej komórki (ryc. 1f i ryc. uzupełniające 5c, 10). To, plus stały mały rozmiar (<400 μm) płatów i wyjątkowo wysoka wierność zachowania, jest niezgodne z selektywnym zachowaniem ciągłego arkusza tkanki in situ. W mniejszości (n = 8) przykładów skóra występuje na krawędzi próbki kopalnych tkanek miękkich, a zatem może potencjalnie reprezentować mniejszy fragment pierwotnie większego kawałka kopalnej skóry (z resztą kawałka na skamieniałej płycie). W większości przykładów, jednakże, cały zarys fragmentu skóry jest zawarty w obrębie marginesu próbki. Badanie marginesów różnych próbek w dużym powiększeniu ujawnia, że próbka i otaczający ją osad często leżą dokładnie w tej samej płaszczyźnie (np. Supplementary Fig. 10). Nawet tam, gdzie margines próbki skóry jest pokryty osadem, jest mało prawdopodobne, że próbka była znacznie większa niż jej pozorny rozmiar, ponieważ kopalna skóra, będąc niemal idealnie płaska, tworzy naturalną płaszczyznę rozłupywania.
Nie ma dowodów na to, że zachowana grubość skóry jest artefaktem preparacji lub erozji. Podczas rozłupywania płyty skalnej, płaszczyzna rozłupywania często przechodzi przez tkanki miękkie w sposób nierównomierny, odsłaniając struktury na różnych głębokościach. W badanych tu skamieniałościach płaszczyzna rozłupywania przechodzi zwykle przez korneocyty (odsłaniając ich strukturę wewnętrzną), a rzadko wzdłuż zewnętrznej powierzchni warstwy korneocytów. Nie ma dowodów na usunięcie więcej niż jednej warstwy korneocytów: Przekroje FIB pokazują zachowanie tylko jednej warstwy, a kilka obrazów SEM pokazuje kompletne pionowe przekroje przez zachowaną skórę (gdzie widoczny jest związek z osadami nad- i podpowierzchniowymi), z dowodami na istnienie tylko jednej warstwy korneocytów. Włókniste wewnętrzne wypełnienie kopalnych korneocytów jest odsłonięte w miejscu, gdzie płaszczyzna rozszczepienia kopalnej płyty przechodzi przez płaty tkanki. Topografia kopalnych korneocytów zmienia się jednak w zależności od położenia płaszczyzny podziału, która może się lokalnie zmieniać w tkankach miękkich w skali milimetrowej: korneocyty mogą występować z podniesionymi brzegami i centralnym wgłębieniem lub z wgłębionymi brzegami i centralną podwyższoną strefą (Fig. S9).
Rozmiar, nieregularna geometria i grubość płatów korneocytów przypominają zrzucone płatki warstwy rogowej (cząstki podobne do łupieżu39; Fig. 3). U ptaków żyjących na wolności korneocyty zrzucane są pojedynczo lub w płatach o powierzchni do 0,5 mm2 , które mogą być uwięzione w piórach (Fig. 3c, d i Supplementary Fig. 2u, v). Opisane tu skamieniałości dostarczają pierwszych dowodów na proces zrzucania skóry u bazalnych ptaków i nieptasich dinozaurów maniraptoranowych i potwierdzają, że przynajmniej niektóre nieptasie dinozaury zrzucają skórę w małych łatkach40. Ten styl zrzucania skóry jest identyczny jak u współczesnych ptaków18 (ryc. 3c, d) i ssaków20 i sugeruje ciągły wzrost somatyczny. Kontrastuje to z wieloma wymarłymi gadami, np, lepidozaurami, które zrzucają skórę w całości lub w dużych fragmentach21, ale na styl zrzucania skóry mogą wpływać takie czynniki jak dieta i środowisko41.
Ewolucyjne implikacje struktury kopalnych korneocytów
Kopalne korneocyty wykazują kluczowe adaptacje znalezione u ich odpowiedników u wymarłych ptaków i ssaków, zwłaszcza ich spłaszczoną wieloboczną geometrię i włóknistą zawartość komórek zgodną z tonofibrylami α-keratyny16. Co więcej, kopalne tonofibryle (podobnie jak w eksterytorialnych przykładach22) wykazują silne połączenia międzykomórkowe i tworzą ciągłe rusztowanie na całej powierzchni korneocytów (ryc. 2b, c, j i Supplementary Fig. 6). W przeciwieństwie do tego, korneocyty u gadów wymarłych zawierają jednorodną masę β-keratyny (z dodatkowymi białkami obecnymi w otoczce komórkowej) i łączą się podczas rozwoju, tworząc dojrzałe β-warstwy bez wyraźnych granic komórkowych42. Zachowanie piknotycznych jąder w kopalnych korneocytach jest wyraźnie ptasią cechą, której nie widać u współczesnych gadów (ale patrz ref. 20).
Uważa się, że morfogeneza i różnicowanie epidermy rozeszły się u terapsydów i zauropsydów31. Nasze dane potwierdzają inne dowody na to, że wspólne cechy naskórka u ptaków i ssaków wskazują na ewolucję konwergentną43 i sugerują, że bogate w lipidy zawartości korneocytów mogą być ewolucyjnie pochodnymi cechami u ptaków i opierzonych nie-awaryjskich maniraptoranów. Badania ewolucyjne sugerują, że ptasi naskórek mógł powstać z ekspansji regionów zawiasowych w „protopierzastej” łuskowatej skórze20. Choć brakuje kopalnych dowodów na to przejście, nasze dane pokazują, że naskórek ptaków bazalnych i nieptasich dinozaurów maniraptorowatych miał już zdecydowanie nowoczesny charakter, nawet u taksonów niezdolnych do lotu. Nie wyklucza to jednak możliwości, że przynajmniej niektóre z opisanych tu cech naskórka pochodzą od bardziej bazalnych teropodów, zwłaszcza tam, gdzie w zachowanej skórze brak jest śladów łusek (jak u Sciurumimus44). Wyrafinowane mechanizmy genomowe modulujące złożoną ekspresję keratyny w naskórku45, terminalne różnicowanie keratynocytów i podział syntezy α- i β-keratyny w skórze opierzonych zwierząt32 zostały prawdopodobnie zmodyfikowane wraz z ewolucją piór blisko podstawy Maniraptora do późnej środkowej jury (ryc. 4). Istniejące dane kopalne sugerują, że nastąpiło to po ewolucji dzioba u Maniraptoriformes, a przed ewolucją patagiów i pteryli na przednich kończynach (ryc. 4); pierwsze kopalne wystąpienia wszystkich tych cech obejmują ok. 10-15 mln lat temu, co sugeruje wybuch innowacji w ewolucji pierzastej powłoki wewnętrznej w pobliżu i przez granicę dolnej i środkowej jury. Najwcześniejsze dowody na istnienie muskulatury skórnej związanej z piórami są o ok. 30 mln lat młodsze, u ptaka ornitotorakowego sprzed 125 mln lat17. Biorąc pod uwagę istotną rolę, jaką odgrywa ta sieć skórna w podtrzymywaniu piór i kontroli ich orientacji18, jej brak u opierzonych maniraptoranów nie-owadów może odzwierciedlać tendencję taphonomiczną.
Schematyczna filogeneza, przeskalowana do czasu geologicznego, wybranych koelurozaurów ukazująca wzorzec nabywania kluczowych modyfikacji skóry. Filogeneza jest najbardziej prawdopodobnym z modeli maksymalnego prawdopodobieństwa, opartym na minimalnych długościach rozgałęzień (mbl) i przejściach występujących jako all-rates-different (ARD). Pazury i opuszki stóp są uważane za prymitywne u celurozaurów. Dostępne dane wskazują, że zmodyfikowane keratynocyty i ciągłe zrzucanie łusek powstały blisko podstawy Maniraptora; Przewiduje się, że na podstawie przyszłych odkryć skamieniałości przesunie się to w kierunku podstawy Coelurosauria, aby objąć inne opierzone taksony
W pewnych aspektach kopalne korneocyty są wyraźnie nie-awskie i wskazują, że opierzone dinozaury i wczesne ptaki miały unikalną anatomię i fizjologię narządów wewnętrznych przejściową między współczesnymi ptakami i nieopierzonymi dinozaurami. U dzisiejszych ptaków tonofibryle korneocytów są luźno rozproszone wśród lipidów wewnątrzkomórkowych19; ułatwia to chłodzenie ewaporacyjne w odpowiedzi na produkcję ciepła podczas lotu i izolację przez upierzenie46. W przeciwieństwie do tego tonofibryle kopalne są gęsto upakowane i wypełniają wnętrze komórki. Nie ma dowodów na pośmiertne kurczenie się kopalnych korneocytów: zakres rozmiarów jest zgodny z tymi u współczesnych ptaków i nie ma dowodów na diagenetyczne pomarszczenie, zniekształcenie czy rozdzielenie poszczególnych komórek. To silnie sugeruje, że zachowana gęstość tonofilamentów w kopalnych korneocytach odzwierciedla pierwotnie wyższą gęstość niż u ptaków żyjących współcześnie. Nie jest to funkcja wielkości ciała: wymarłe ptaki o różnej wielkości (np. zeberka i struś) wykazują luźno rozproszone tonofibryle47. Ptaki kopalne miały więc prawdopodobnie niższe fizjologiczne zapotrzebowanie na chłodzenie ewaporacyjne, a co za tym idzie, niższą produkcję ciepła w organizmie związaną z aktywnością lotniczą46 niż u ptaków współczesnych. Jest to zgodne z innymi dowodami na niską podstawową przemianę materii u nieazjatyckich dinozaurów maniraptoran47,48 i ptaków bazalnych47 oraz z hipotezami, że pióra Microraptor49 i, potencjalnie, Confuciusornis48 (ale patrz ref. 50) nie były przystosowane do lotu z napędem, przynajmniej przez dłuższy czas50.
.