Abstract
Testy molekularne i immunologiczne obiecują lepszą, szybszą diagnostykę laboratoryjną aspergilozy, ale mikroskopia i hodowla pozostają powszechnie stosowanymi i niezbędnymi narzędziami. Zmiany proceduralne, jak również odpowiednie szkolenie pracowników laboratorium, mogą zwiększyć wartość tych tradycyjnych narzędzi. Stosowanie Blankophoru lub Calcofluoru do badań mikroskopowych; poprawa rozpoznawania cech morfologicznych grzybów oportunistycznych w wybarwionych rozmazach próbek; maksymalizacja tempa wzrostu i produkcji konidiów przez Aspergillus spp. w hodowli; oraz rozpoznawanie atypowych wariantów pospolitych aspergilli może poprawić wkład laboratorium w szybką diagnostykę. Badania wskazują, że liczba specjalistów laboratoryjnych maleje, podczas gdy zapotrzebowanie na opiekę zdrowotną rośnie. Skuteczna rekrutacja, zatrzymanie i szkolenie personelu muszą być zbieżne z postępem technologicznym.
Wprowadzenie
Tradycyjne metody diagnostyki aspergilozy i innych grzybic są uzupełniane przez podejścia molekularne i immunologiczne. Chociaż zalety testów opartych na kwasach nukleinowych są oczywiste, ich standaryzacja i użyteczność kliniczna nie zostały w pełni zrealizowane. Ponadto, podczas gdy test EIA galaktomannanu dla antygenu Aspergillus jest szeroko dostępny w USA, standardowe wykorzystanie testów opartych na kwasach nukleinowych do identyfikacji izolatów klinicznych wydaje się ograniczone. Laboratoria referencyjne oferujące molekularną identyfikację aspergilli to Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Holandia, oraz laboratoria w USA wymienione w internetowym katalogu testów Association for Molecular Pathology. Chociaż metody molekularne są coraz doskonalsze i łatwiej dostępne, mikroskopia i hodowla pozostają podstawowymi narzędziami laboratoryjnymi do wykrywania aspergilli. W 2003 roku American Society for Microbiology (ASM) Benchmarking Survey udokumentowało, że 89% laboratoriów wykonujących badania mikologiczne stosuje hodowlę, 16% serologię, a mniej niż 5% stosuje testy molekularne. Tylko 3% laboratoriów sprawozdawczych stosuje „domowej roboty” testy molekularne dla patogenów mikrobiologicznych. Biorąc pod uwagę ciągłe poleganie na mikroskopii i hodowli, wartość diagnostyczna tych metod musi być zwiększona poprzez zmiany proceduralne i odpowiednie szkolenie personelu laboratoryjnego.
Mikroskopia
Mikroskopowe metody, takie jak mokry montaż, barwienie metodą Grama i konwencjonalna histopatologia, dostarczają wskazówek sugerujących obecność Aspergillus spp. w tkance. Blankophor lub Calcofluor zmieszany z 10%-20% wodorotlenkiem potasu (KOH), barwi ściany komórkowe grzybów i poprawia ich wykrywalność. Podczas gdy kalkofluor krystalizuje się w zasadowym pH, Blankophor nie i może być przechowywany w roztworze roboczym do roku. Markery fenotypowe wykrywane przez barwienia histopatologiczne, jak również przez barwienie metodą Grama lub mokre preparaty, dostarczają cennych informacji dla klinicznie ważnych grzybów, szczególnie w przypadku braku hodowli (Tabela 1). Jednakże, potwierdzenie wyników badań mikroskopowych przez hodowlę jest zawsze pożądane, a w większości przypadków dotyczących oportunistycznych grzybów pleśniowych, niezbędne do ostatecznej identyfikacji patogenu. Pomimo obecności wizualnych wskazówek, identyfikacja aspergilli wyłącznie za pomocą mikroskopu może być myląca. Schell opisuje przypadek Aspergillus niger sinusitis, w którym konidia A. niger zostały pomylone z komórkami drożdżaków Candida spp. a przekroje poprzeczne strzępek A. niger zostały pomylone z szerokimi hyfusami zygomycety. Komunikacja między patologiem klinicznym a mikologiem laboratoryjnym, który rutynowo identyfikuje grzyby strzępkowe z hodowli, może poprawić wartość diagnostyczną histopatologii.
Mikroskopowe markery wybranych gatunków Aspergillus i innych oportunistycznych patogenów grzybiczych.
| Organizm (s) . | Mikroskopowe markery w preparatach szkiełkowych próbek przygotowanych według standardowych procedur* . | |
|---|---|---|
| . | Hyphae . | Inne cechy . |
| A. fumigatus | 2,5-8 µm szerokości, przegrodowate, hialinowe, rozgałęzienie pod ostrym kątem, rozgałęzienie drzewkowate lub wachlarzowate. Stipes mogą przypominać hyphae zygomycetes | Główka konidialna uniseriate, kolumnowa, konidia w łańcuszkach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. niger | Zobacz A. fumigatus | Głowa konidialna dwuseryjna, promienista, konidia w łańcuchach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. terreus | Zobacz A. fumigatus | Małe, okrągłe, hialinowe konidia („akcesoryjne” konidia) przyczepione do wegetatywnych hyphae |
| Acremonium, Fusarium, and Paecilomyces spp | Patrz A. fumigatus | Phialidy i phialoconidia, specyficzne dla rodzaju, mogą być znalezione w zamkniętej tkance |
| Scedosporium apiospermum | Patrz A. fumigatus | Typowe annellokonidia i annellidy mogą występować w tkance zamkniętej |
| Zygomycetes | 10-30 µm szerokie, aseptyczne, nie promieniujące, rozgałęziające się pod kątem 90°. Fałdy w hyphae mogą symulować septae | |
| Pleśnie dematiaceus | Hyphae z brązową pigmentacją; ściany często nie równoległe; może wydawać się moniliform (jak „sznur paciorków”) | Brązowy pigment widoczny w badaniu KOH z oświetleniem jasnego pola; barwione Fontana-Masson i często Hematoksyliną i Eozyną |
| Organizm (s) . | Mikroskopowe markery w preparatach szkiełkowych próbek przygotowanych według standardowych procedur* . | |
|---|---|---|
| . | Hyphae . | Inne cechy . |
| A. fumigatus | 2,5-8 µm szerokości, przegrodowate, hialinowe, rozgałęzienie pod ostrym kątem, rozgałęzienie drzewkowate lub wachlarzowate. Stipes mogą przypominać hyphae zygomycetes | Główka konidialna uniseriate, kolumnowa, konidia w łańcuszkach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. niger | Zobacz A. fumigatus | Głowa konidialna dwuseryjna, promienista, konidia w łańcuchach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. terreus | Zobacz A. fumigatus | Małe, okrągłe, hialinowe konidia („akcesoryjne” konidia) przyczepione do wegetatywnych hyphae |
| Acremonium, Fusarium, and Paecilomyces spp | Patrz A. fumigatus | Phialidy i phialoconidia, specyficzne dla rodzaju, mogą być znalezione w zamkniętej tkance |
| Scedosporium apiospermum | Patrz A. fumigatus | Typowe annellokonidia i annellidy mogą występować w tkance zamkniętej |
| Zygomycetes | 10-30 µm szerokie, aseptyczne, niepromieniste, rozgałęziające się pod kątem 90°. Fałdy w hyfusach mogą symulować przegrody | |
| Pleśnie dematiaceutyczne | Hyfusy z brązową pigmentacją; ściany często nie są równoległe; mogą sprawiać wrażenie moniliformalnych (jak „sznur paciorków”) | Brązowy pigment widoczny w badaniu KOH przy oświetleniu jasnym polem; barwione Fontana-Masson i często Hematoksyliną i Eozyną |
Do dokładnej oceny markerów wymagana jest fachowa wiedza w zakresie identyfikacji pleśni. Wyniki muszą być potwierdzone hodowlą.
Mikroskopowe markery wybranych gatunków Aspergillus i innych oportunistycznych patogenów grzybiczych.
| Organizm (s) . | Mikroskopowe markery w preparatach szkiełkowych próbek przygotowanych według standardowych procedur* . | |
|---|---|---|
| . | Hyphae . | Inne cechy . |
| A. fumigatus | 2,5-8 µm szerokości, przegrodowate, hialinowe, rozgałęzienie pod ostrym kątem, rozgałęzienie drzewkowate lub wachlarzowate. Stipes mogą przypominać hyphae zygomycetes | Główka konidialna uniseriate, kolumnowa, konidia w łańcuszkach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. niger | Zobacz A. fumigatus | Głowa konidialna dwuseryjna, promienista, konidia w łańcuchach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. terreus | Zobacz A. fumigatus | Małe, okrągłe, hialinowe konidia („akcesoryjne” konidia) przyczepione do wegetatywnych hyphae |
| Acremonium, Fusarium, and Paecilomyces spp | Patrz A. fumigatus | Phialidy i phialoconidia, specyficzne dla rodzaju, mogą być znalezione w zamkniętej tkance |
| Scedosporium apiospermum | Patrz A. fumigatus | Typowe annellokonidia i annellidy mogą występować w tkance zamkniętej |
| Zygomycetes | 10-30 µm szerokie, aseptyczne, niepromieniste, rozgałęziające się pod kątem 90°. Fałdy w hyphae mogą symulować septae | |
| Pleśnie dematiaceus | Hyphae z brązową pigmentacją; ściany często nie równoległe; może wydawać się moniliform (jak „sznur paciorków”) | Brązowy pigment widoczny w badaniu KOH z oświetleniem jasnego pola; barwione Fontana-Masson i często Hematoksyliną i Eozyną |
| Organizm (s) . | Mikroskopowe markery w preparatach szkiełkowych próbek przygotowanych według standardowych procedur* . | |
|---|---|---|
| . | Hyphae . | Inne cechy . |
| A. fumigatus | 2,5-8 µm szerokości, przegrodowate, hialinowe, rozgałęzienie pod ostrym kątem, rozgałęzienie drzewkowate lub wachlarzowate. Stipes mogą przypominać hyphae zygomycetes | Główka konidialna uniseriate, kolumnowa, konidia w łańcuszkach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. niger | Zobacz A. fumigatus | Głowa konidialna dwuseryjna, promienista, konidia w łańcuchach lub oderwane i rozproszone. Pojedyncze lub sparowane konidia mogą przypominać komórki drożdży |
| A. terreus | Zobacz A. fumigatus | Małe, okrągłe, hialinowe konidia („akcesoryjne” konidia) przyczepione do wegetatywnych hyphae |
| Acremonium, Fusarium, and Paecilomyces spp | Patrz A. fumigatus | Phialidy i phialoconidia, specyficzne dla rodzaju, mogą być znalezione w zamkniętej tkance |
| Scedosporium apiospermum | Patrz A. fumigatus | Typowe annellokonidia i annellidy mogą występować w tkance zamkniętej |
| Zygomycetes | 10-30 µm szerokie, aseptyczne, niepromieniste, rozgałęziające się pod kątem 90°. Fałdy w hyfusach mogą symulować przegrody | |
| Pleśnie dematiaceutyczne | Hyfusy z brązową pigmentacją; ściany często nie są równoległe; mogą sprawiać wrażenie moniliformalnych (jak „sznur paciorków”) | Brązowy pigment widoczny w badaniu KOH przy oświetleniu jasnym polem; barwione Fontana-Masson i często Hematoksyliną i Eozyną |
Do dokładnej oceny markerów wymagana jest fachowa wiedza w zakresie identyfikacji pleśni. Wyniki muszą być potwierdzone przez hodowlę.
Rozpoznawanie cech morfologicznych
Ponieważ aspergilli są wszechobecne w przyrodzie, mogą powszechnie zanieczyszczać próbki i podłoża hodowlane. W związku z tym określenie znaczenia Aspergillus spp. rosnących w hodowli jest często wyzwaniem, gdy wynik badania mikroskopowego próbki jest negatywny. W badaniu izolatów Aspergillus od biorców przeszczepów wątroby i nerki, Brown i wsp. stwierdzili, że obecność więcej niż dwóch kolonii w hodowli i zakażenie w więcej niż jednym miejscu zapowiadają znaczące zakażenie. U pacjentów z granulocytopenią z ostrą białaczką, pojedyncza izolacja z próbki z dolnych dróg oddechowych musi być uznana za znaczącą. Jednoznaczne raporty z obserwacji laboratoryjnych dla lekarza mogą zmniejszyć dylemat diagnostyczny. Na przykład, stwierdzenie „W sumie trzy kolonie Aspergillus fumigatus wyizolowane na dwóch z trzech płytek” dostarcza więcej informacji niż „Wyizolowano rzadkie A. fumigatus”.
Optymalizacja wyników hodowli
Isolacja w hodowli i identyfikacja fenotypowa powszechnych klinicznych izolatów Aspergillus spp. jest zwykle szybka i łatwa. Jednakże, hodowla jest często opisywana jako powolna, co może powodować błędne przekonania co do jej wartości w wykrywaniu aspergilli. A. fumigatus jest grzybem szybko rosnącym. Typowe aksamitne, szaro-niebiesko-zielone kolonie i jednopostaciowe główki konidialne rozwijają się w ciągu 24-48 godzin zarówno na podłożach grzybiczych, jak i na agarze z krwią owczą, powszechnie używanym do hodowli bakterii. Inne aspergilusy związane z inwazyjną aspergilozą, a mianowicie A. flavus, A. niger, A. nidulans i A. terreus mają tempo wzrostu podobne do A. fumigatus, gdy kolonie były mierzone na agarze z ekstraktem słodowym i agarze drożdżowym Czapek po inkubacji przez siedem dni w temperaturze 25°C i 37°C. Ponieważ oporność niektórych Aspergillus spp. na leki jest zagrożeniem, pełna identyfikacja, nie tylko A. fumigatus, ale także rzadziej izolowanych gatunków, jest uzasadniona. Naukowcy laboratoryjni muszą również rozpoznawać nietypowe izolaty Aspergillus spp. Ostatnio opisano słabo sporulujące (białe) szczepy A. fumigatus o obniżonej wrażliwości na kilka leków przeciwgrzybiczych. Te białe szczepy mają sekwencję genetyczną inną niż szczep typu dzikiego, A. fumigatus Fresenius, i nie wykształciły typowych niebiesko-zielonych główek konidialnych do 10-12 dni po inkubacji. Kolejnym wyzwaniem jest biała pleśń, Neosartorya fisheri, która początkowo wytwarza skąpe główki konidialne, przypominające te z A. fumigatus. Jednakże, N. fisheri rozwija następnie liczne, okrągłe, cienkościenne cleistothecia, co ułatwia odróżnienie jej od A. fumigatus. Do szybkiej lokalizacji główek konidialnych i cleistothecia przydatna jest luneta sekcyjna. Mogą występować jałowe, białe, szybko rosnące lub gruzełkowate, kopcowate, wolno rosnące izolaty A. fumigatus, które wymagają badania termotolerancji i egzoantygenów w celu ostatecznej identyfikacji. Khan i wsp. opisali atypowego A. terreus wyizolowany z materiału pobranego z dolnych dróg oddechowych od pacjenta z aspergilloma. Początkowe kolonie były pomarańczowe i wytwarzały dyfuzyjny żółty pigment oraz małe, pojedyncze komórki, które były mylone z konidiami Scedosporium apiospermum. Wytrącające się przeciwciała i typowe główki konidialne A. terreus wytworzone po 10 tygodniach inkubacji potwierdziły identyfikację.
Obrazy i informacje dostępne w podręcznikach i w Internecie oferują doskonałe możliwości edukacyjne do nauki identyfikacji Aspergillus spp. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) i CBS oferują warsztaty laboratoryjne. W przypadku, gdy wyjazd poza teren laboratorium nie jest praktyczny, zachęca się laboratoria do korzystania z samouczka online, Aspergillus Reference Cultures , do szkoleń wewnętrznych. Wymienione tam organizmy referencyjne są dostępne do nabycia w głównych kolekcjach kultur.
Analizowanie każdego etapu procedury hodowlanej może prowadzić do poprawy odzysku aspergilli. Upłynnianie próbek sputolizyną lub innymi środkami mukolitycznymi zostało zasugerowane w celu odzyskania grzybów uwięzionych w śluzie plwociny i materiału z zatok pobranego podczas operacji endoskopowych. Stosowanie dekstrozy ziemniaczanej, płatków ziemniaczanych, ekstraktu słodowego, agaru z inhibitorami pleśni lub podobnych agarów sporulacyjnych jako podstawowych podłoży izolacyjnych dla Aspergillus spp. może przyspieszyć tempo wzrostu i wytwarzanie konidiów. Dodanie środków przeciwbakteryjnych do podłoży izolacyjnych pomaga skrócić czas identyfikacji poprzez zahamowanie wzrostu bakterii i zmniejszenie potrzeby podhodowli. Początkowa inkubacja pożywek grzybiczych w temperaturze 35-37°C zamiast lub dodatkowo w 30°C może przyspieszyć wzrost niektórych aspergilli. Podobnie, codzienna kontrola pożywek zapewnia jak najwcześniejsze wykrycie. Poprzez inkubację płytek hodowlanych w środowisku mikroaerofilnym w temperaturze 35°C, Tarrand stwierdził, że wybrane, klinicznie ważne Aspergillus spp. wyrosły z 12 z 12 posiewów bulionowych. Hodowle tych samych organizmów inkubowane w temperaturze 25°C bez CO2 nie dały pozytywnych wyników. Dalsze badania byłyby pomocne w wyjaśnieniu, które podłoża i warunki są najbardziej skuteczne w odzyskiwaniu i szybkiej identyfikacji klinicznie ważnych aspergilli.
Zwykle można zidentyfikować główki konidialne Aspergillus spp. poprzez szybkie wykonanie posiewu na taśmie Scotcha lub tease mount. Jednakże, w przypadku powolnego lub nietypowego przebiegu sporulacji, konieczne może być wykonanie posiewu na szkiełko mikroskopowe. Szybkie tempo pracy większości laboratoriów szpitalnych narzuca najłatwiejszą, choć niekoniecznie najbardziej wyrafinowaną, metodę wykonania posiewu. Klasyczna metoda posiewu slajdów Riddella została uzupełniona o inne, mniej pracochłonne techniki. Szybka metoda polega po prostu na wciśnięciu szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 × 18 mm pod kątem 45 stopni w podłoże sporulacyjne, takie jak agar z płatkami ziemniaczanymi. Kiedy pleśń sporuluje, szkiełko nakrywkowe jest ostrożnie wyjmowane z agaru i umieszczane w kropli błękitu laktofenolowego lub laktofuchsyny na szkiełku mikroskopowym. Kolejną kroplę umieszcza się na małym szkiełku nakrywkowym przed zakończeniem montażu za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 × 22 mm.
Kwestie dotyczące siły roboczej
Szybka diagnostyka aspergilozy zależy nie tylko od ulepszonej metodologii, ale także od odpowiedniej, dobrze wyszkolonej siły roboczej. Badania praktyk mikologicznych zdecydowanie zalecają więcej szkoleń. Szczególny nacisk powinien być położony na dokładną identyfikację, bezpośrednie badanie, odpowiednie wykorzystanie mediów, znaczenie kliniczne i efektywność kosztową. Nieodpowiednia liczba personelu może jednak uniemożliwić zarówno szkolenie, jak i wdrożenie bardziej istotnych klinicznie procedur. Badanie ASM Benchmarking Survey ujawniło utrzymujące się braki kadrowe w niektórych laboratoriach mikrobiologicznych w USA. Częściowo niedobór ten wynika z 53%-56% redukcji programów szkoleniowych CLS w ciągu ostatnich 12 lat. Trzydzieści cztery procent specjalistów pracujących obecnie w laboratoriach mikrobiologicznych ma więcej niż 50 lat. Czy młodsi pracownicy będą w stanie ich zastąpić, gdy odejdą na emeryturę? Podczas gdy prawie 80% kobiet w wieku produkcyjnym ma mniej niż 30 lat, tylko 10% kobiet pracujących w laboratoriach mikrobiologicznych ma mniej niż 30 lat. Dane te sugerują, że niedobory siły roboczej będą się utrzymywać i być może nasilać.
Wniosek
Poprawa zarówno tradycyjnych, jak i nietradycyjnych procedur diagnostycznych dla grzybic wymaga jednoczesnych wysiłków w celu zapewnienia odpowiedniej siły roboczej i poprawy mobilności kariery, uznania zawodowego, możliwości zaawansowanego szkolenia, rekompensaty i innych czynników potrzebnych do stymulowania zainteresowania naukami laboratoryjnymi.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
. ,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
Jr
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, i in.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
. ,
,
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, et al.
,
,
8
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
. ,
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(str.
–
)
.
,
,
.
,
,
(str.
–
)
,
,
. ,
,
pg.
.
,
,
, t.
(str.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
. ,
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, i in.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.