Lysozyme był pierwszym enzymem, dla którego struktura rentgenowska została określona w wysokiej rozdzielczości. Udało się to w 1965 roku Davidowi Phillipsowi, pracującemu w Royal Institution w Londynie. Phillips zaproponował mechanizm działania lizozymu, który opierał się głównie na danych strukturalnych. Mechanizm Phillipsa został od tego czasu potwierdzony przez dowody doświadczalne, jak zobaczymy później.
Lizozym występuje powszechnie w komórkach i wydzielinach (w tym łzach i ślinie) kręgowców, a białko jaja kurzego jest szczególnie bogate w ten enzym. Lizozym katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych, które łączą kwas N-acetylomuraminowy (NAM) i N-acetyloglukozaminę (NAG) w polisacharydach ścian komórkowych bakterii. W ten sposób uszkadza integralność ściany komórkowej i tym samym działa jako środek bakteriobójczy. Wiązanie NAM-NAG jest przedstawione na rysunku 40, ze wskazaniem miejsca rozszczepienia przez lizozym.
Lizozym jest stosunkowo małym enzymem. Lizozym białka jaja kurzego składa się z pojedynczego polipeptydu o długości 129 aminokwasów (Rysunek 41) i Mr 14 600. Z danych dyfrakcji rentgenowskiej wynika, że w strukturze lizozymu występuje wyraźne rozszczepienie (Rysunek 42). Miejsce aktywne znajduje się w tej szczelinie. W sekwencji aminokwasowej na Rysunku 41 i w wypełniającym przestrzeń modelu lizozymu na Rysunku 42 zaznaczono te reszty, które wyznaczają kieszeń wiążącą substrat w złożonym białku.
Miejsce aktywne lizozymu jest długim rowkiem, który może pomieścić sześć cukrów z łańcucha polisacharydowego jednocześnie. Po związaniu polisacharydu enzym hydrolizuje jedno z wiązań glikozydowych. Jeśli sześć cukrów w danym odcinku polisacharydu jest oznaczonych jako A-F, miejsce rozszczepienia znajduje się pomiędzy D i E, jak pokazano na Rysunku 40. Następnie uwalniane są dwa fragmenty polisacharydu. Rysunek 43 przedstawia etapy tej reakcji, które są również szczegółowo opisane poniżej.
-
Po związaniu z enzymem substrat przyjmuje napiętą konformację. Rezydencja D jest zniekształcona (nie pokazana na schemacie), aby pomieścić grupę -CH2OH, która w przeciwnym razie mogłaby wejść w niekorzystny kontakt z enzymem. W ten sposób enzym zmusza substrat do przyjęcia konformacji zbliżonej do konformacji stanu przejściowego.
-
Residą 35 enzymu jest kwas glutaminowy (Glu 35) z protonem, który łatwo przenosi na polarny atom O wiązania glikozydowego. W ten sposób wiązanie C-O w substracie zostaje rozszczepione (Rysunek 43a i b).
-
Residue D polisacharydu ma teraz ładunek dodatni netto; ten półprodukt reakcji znany jest jako jon oksoniowy (Rysunek 43b). Enzym stabilizuje ten półprodukt na dwa sposoby. Po pierwsze, pobliska reszta asparaginianowa (Asp 52), która jest ujemnie naładowana w formie karboksylanowej, oddziałuje z dodatnim ładunkiem jonu oksonowego. Po drugie, zniekształcenie reszty D umożliwia podział ładunku dodatniego pomiędzy jej atom C i O. (Zauważmy, że to dzielenie się ładunkiem między atomami jest określane mianem rezonansu w taki sam sposób, jak dzielenie się elektronami między atomami grupy peptydowej). Tak więc stanem przejściowym jest jon oksoniowy. Normalnie, taki stan pośredni byłby bardzo niestabilny i reaktywny. Asp 52 pomaga w stabilizacji jonu oksoniowego, ale nie reaguje z nim. Dzieje się tak dlatego, że w odległości 3 Å grupy reaktywne są zbyt daleko od siebie.
-
Enzym uwalnia teraz resztę E z dołączonym do niej polisacharydem, dając pośredni związek glikozylo-enzymatyczny. Jon oksoniowy reaguje z cząsteczką wody ze środowiska rozpuszczalnika, wyodrębniając grupę hydroksylową i reprotonując Glu 35 (Rysunek 43c i d).
-
Enzym uwalnia następnie resztę D z przyłączonym polisacharydem i reakcja jest zakończona.
-
Mechanizm katalityczny lizozymu obejmuje zarówno katalizę ogólną kwasową, jak i ogólną zasadową. Które reszty biorą udział w tych zdarzeniach?
-
Glu 35 uczestniczy w katalizie kwasowej (oddaje proton), a Asp 52 w katalizie zasadowej (stabilizuje dodatni ładunek jonu oksoniowego).
Przedstawiony powyżej mechanizm katalizy lizozymu według Phillipsa jest poparty wieloma obserwacjami eksperymentalnymi. W szczególności, znaczenie Glu 35 i Asp 52 w tym procesie zostało potwierdzone przez eksperymenty mutagenezy kierowanej miejscem (SDM). SDM jest bardzo skuteczną techniką badania roli poszczególnych reszt aminokwasowych w funkcji białka i zostanie omówiona szczegółowo w rozdziale 7.2. SDM polega na wykorzystaniu technologii rekombinowanego DNA do selektywnego zastąpienia interesującej nas reszty innym aminokwasem o zasadniczo odmiennych właściwościach. Powstałe w ten sposób białko może być następnie testowane funkcjonalnie, np. w odniesieniu do wiązania substratów lub aktywności katalitycznej. Kiedy zastosowano tę technikę do lizozymu, zastępując Glu 35 reszt± glutaminową (Gln), otrzymane białko mogło nadal wiązać substrat (choć słabiej), ale nie wykazywało aktywności katalitycznej. Glu 35 jest więc niezbędny dla katalitycznej aktywności lizozymu. Kiedy Asp 52 zastąpiono resztą asparaginową (Asn), zmutowane białko miało mniej niż 5% aktywności katalitycznej normalnego lizozymu (typu dzikiego), pomimo faktu, że forma zmutowana miała w rzeczywistości dwukrotnie wyższe powinowactwo do substratu. Wynika z tego, że Asp 52 jest niezbędny dla aktywności katalitycznej lizozymu. Eksperymenty z użyciem środków chemicznych, które kowalencyjnie zmodyfikowały te reszty, bez znaczącego wpływu na strukturę rentgenowską, podobnie udowodniły, że są one niezbędne dla aktywności katalitycznej.