Relationship between the Size of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Reservoir in Peripheral Blood CD4+ T Cells and CD4+:CD8+ T Cell Ratios in Aviremic HIV-1-Infected Individuals Receiving Long-Term Highly Active Antiretroviral Therapy

Abstract

Zostało wykazane, że replikacja ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) utrzymuje się u większości zakażonych osób otrzymujących wysoce aktywną terapię antyretrowirusową (HAART). Brakowało jednak badań dotyczących zależności pomiędzy niskim poziomem trwającej replikacji wirusa a parametrami immunologicznymi, takimi jak stosunek komórek T CD4+:CD8+ u takich osób. W niniejszej pracy wykazano istotną statystycznie odwrotną korelację między częstością komórek CD4+ T niosących prowirusowe DNA HIV-1 a stosunkiem komórek CD4+:CD8+ T u zakażonych osób otrzymujących HAART, u których wiremia w osoczu była obniżona poniżej granicy wykrywalności przez dłuższy czas. Nie stwierdzono korelacji między częstością swoistych dla HIV-1 cytotoksycznych limfocytów T CD8+ (CTLs) a stosunkiem komórek T CD4+ :CD8+ u tych osób. Dane te sugerują, że utrzymująca się na niskim poziomie, trwająca replikacja wirusowa, choć niewystarczająca do utrzymania specyficznych dla HIV-1 odpowiedzi CTL, może częściowo wyjaśniać, dlaczego normalizacja stosunku komórek T CD4+ :CD8+ nie jest osiągana u niektórych zakażonych osób skutecznie leczonych HAART.

Zastosowanie wysoce aktywnej terapii antyretrowirusowej (HAART) w leczeniu osób zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 (HIV- 1) radykalnie zmieniło wyniki kliniczne dla wielu zakażonych osób i doprowadziło do znacznego spadku zachorowalności na AIDS i śmiertelności. Jednakże, obecność wirusa zdolnego do replikacji, prowirusowego DNA HIV-1 (w tym 2 długie końcowe kręgi powtórzenia), spliced i unspliced HIV-1 RNA w komórkach CD4+ T, oraz niezidentyfikowanych rezerwuarów wirusa została wykazana u większości zakażonych osób, u których wiremia w osoczu spadła poniżej granicy wykrywalności, a te źródła trwającej replikacji stały się główną przeszkodą w zapobieganiu eradykacji HIV-1.

Po rozpoczęciu HAART wiremia w osoczu szybko spada do poziomu poniżej granicy wykrywalności u dużego odsetka zakażonych osób, a następnie następuje stopniowy wzrost liczby komórek T CD4+ i spadek liczby komórek T CD8+. Jednakże, normalizacja stosunku komórek T CD4+:CD8+ nie jest osiągana u niektórych zakażonych osób, które z powodzeniem zareagowały na HAART. W związku z tym sugeruje się, że chronicznie podwyższony poziom limfocytów T CD8+ lub nieprawidłowy stosunek limfocytów T CD4+:CD8+ we krwi obwodowej wynika z aktywnej replikacji wirusa u osób zakażonych, które nie są leczone lub otrzymują suboptymalną terapię przeciwwirusową. Ponadto wykazano, że ekspresja markera aktywacji CD38 na komórkach T CD8+ jest markerem prognostycznym progresji choroby. Chociaż sugerowano, że brak normalizacji stosunku komórek T CD4+:CD8+ u niektórych pacjentów otrzymujących HAART wynika z niepełnej supresji replikacji wirusa, nie ma danych dotyczących tego zagadnienia, zwłaszcza u pacjentów, którzy otrzymywali HAART przez dłuższy czas i u których wiremia w osoczu została dobrze zahamowana.

Zostało ustalone, że rezerwuar zakażonych komórek CD4+ T we krwi obwodowej, określony przez liczbę komórek niosących prowirusowe DNA HIV-1, jest utrzymywany przez trwającą replikację wirusową, nawet na bardzo niskim poziomie. W obecnym badaniu ocenialiśmy związek między stosunkiem liczby komórek T CD4+:CD8+ a częstością komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1 w oczyszczonych komórkach T CD4+, a także częstością swoistych dla HIV cytotoksycznych limfocytów T CD8+ (CTL) u zakażonych osób, które otrzymywały HAART przez dłuższy czas i u których wiremia w osoczu została stłumiona poniżej poziomu wykrywalności, jak określono za pomocą standardowych testów.

Pacjenci i metody

Isolacja komórek T CD4+. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) uzyskano przez wirowanie w gradiencie gęstości ficoll-hypaque. Komórki T CD4+ izolowano z PBMC osób zakażonych HIV-1, stosując technikę separacji komórek opartą na kolumnach (Stem-Cell Technologies), jak opisano w innym miejscu .

Ilościowy real-time HIV-1 DNA PCR. Aby określić częstotliwość komórek CD4+ T niosących prowirusa HIV-1 u zakażonych osób, przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano poniżej. Genomowy DNA został wyizolowany z 1-2 × 106 oczyszczonych komórek CD4+ T, przy użyciu zestawu do izolacji DNA Puregene (Gentra), zgodnie ze specyfikacją producenta. DNA (1 µg) wykorzystano jako szablon do reakcji PCR w czasie rzeczywistym w urządzeniu iCycler (Bio-Rad). Reakcję amplifikacji przeprowadzono w trzech powtórzeniach z użyciem 0,5 µM primerów, 0,2 µM sondy fluorescencyjnej, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2 i 2,5 U Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) w całkowitej objętości 50 mL. Użyto primerów 5′- GGTCTCTCTGTTAGACCAGAT-30 (primer 5′) i 5′-CTGCTAGAGATTTCCACACTG-3′ (primer 3′) wraz z sondą fluorescencyjną 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTAMRA- 3′. Warunki PCR składały się z etapu denaturacji w 95°C przez 3 min, a następnie 45 cykli 15 s w 95°C i 1 min w 58°C. Seryjnie rozcieńczone DNA ACH-2 również poddano powyższemu PCR w celu uzyskania krzywych standardowych.

Cytometryczna analiza przepływowa komórek T CD8+ specyficznych dla HIV-1. Częstość komórek CD8+ T swoistych dla HIV-1 określono na podstawie analizy wewnątrzkomórkowych komórek interferonowych (IFN)-γ-dodatnich po stymulacji peptydami swoistymi dla HIV-1 (20 mer nakładających się na 15 aa). Pule nakładających się peptydów (1 µg każdy; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) obejmujące całą sekwencję HIV-1 gag, pol, env i nef były początkowo inkubowane z 3 × 106 PBMC przez 10 min w okrągłodennej probówce o pojemności 5 ml (Becton Dickinson) w 0,1 mL kompletnego medium w inkubatorze CO2 w 37°C. Następnie do probówki dodawano 0,4 mL kompletnej pożywki, a po 2-godzinnej inkubacji do pożywki dodawano Brefeldin A (Sigma) w końcowym stężeniu 10 mg/mL w celu zahamowania wydzielania IFN-γ. Po 6 h inkubacji komórki przemywano dwukrotnie, utrwalano 1× roztworem utrwalającym (Becton Dickinson) przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie przemywano. Komórki permeabilizowano 1× roztworem permeabilizacyjnym 2 (Becton Dickinson), a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Po ponownym wypłukaniu komórki barwiono przeciwciałami: sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny anty-CD8, sprzężonym z fikoerytryną anty-IFN-γ, sprzężonym z białkiem chlorofilowym perydyny anty-CD69 i sprzężonym z alofiliną anty-CD3 (Becton Dickinson). Przy bramce na limfocytach CD3+CD8+ zebrano ~100 000 zdarzeń, używając urządzenia FACSCalibur (Becton Dickinson), a częstość komórek IFN-γ + CD69+ określono przy użyciu oprogramowania Cellquest (Becton Dickinson).

Analiza statystyczna. Korelacja rang Spearmana została wykorzystana jako miara korelacji między (1) częstością komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1 a liczbą komórek T CD4+ i CD8+ oraz stosunkiem komórek T CD4+:CD8+ i (2) częstością CTL swoistych dla HIV-1 oraz liczbą komórek T CD4+ i CD8+, stosunkiem komórek T CD4+:CD8+ i liczbą komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1. Dokładny test Fishera został użyty do określenia związku stosunku komórek T CD4+:CD8+ ⩾1,0 lub <1,0 z ładunkami prowirusowymi w przedziale komórek T CD4+. Metodę Bonferroniego dla dostosowania wartości P dla testów wielokrotnych zastosowano do korelacji liczby komórek T CD4+ i CD8+ oraz stosunku komórek T CD4+:CD8+ z częstością komórek T CD4+ przenoszących prowirusowe DNA HIV-1, a także zastosowano ją do korelacji liczby komórek T CD4+ i CD8+, stosunku komórek T CD4+:CD8+ oraz poziomów prowirusowego DNA HIV-1 w przedziale komórek T CD4+ z częstością CTL swoistych dla HIV-1.

Wyniki

Zależność między wielkością rezerwuaru komórek T CD4+ HIV-1 a parametrami immunologicznymi. Aby zbadać związek między wielkością rezerwuaru komórek CD4+ T krwi obwodowej dla HIV-1 a nieprawidłowymi obwodowymi parametrami immunologicznymi u zakażonych osób otrzymujących skuteczną HAART przez dłuższy czas, staraliśmy się ustalić korelacje między częstością komórek CD4+ T niosących prowirusowe DNA HIV-1 a liczbą komórek T CD4+ i CD8+ oraz stosunkiem komórek T CD4+ :CD8+. Stwierdzono statystycznie istotną odwrotną korelację między częstością komórek CD4+ T niosących prowirusowe DNA HIV-1 a liczbą komórek CD4+ T we krwi obwodowej zakażonych osób, które badaliśmy (P = .02; Figura 1A). W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono korelacji między ładunkiem prowirusowego DNA HIV-1 w komórkach CD4 + T a liczbą komórek CD8 + T (P = .34; Figura 1B). Kiedy te 2 parametry immunologiczne zostały połączone i wyrażone jako stosunek komórek T CD4+:CD8+, zaobserwowano silną odwrotną korelację między tymi wartościami a częstością komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1 (P .01; Figura 1C). Ponadto 14 (74%) z 19 pacjentów ze stosunkiem komórek T CD4+:CD8+ ,1,0 miało ładunki prowirusowe DNA HIV-1 o wartości <1000 kopii/µg genomowego DNA pochodzącego z komórek T CD4+. Przeciwnie, 10 (77%) z 13 pacjentów ze stosunkiem komórek CD4+:CD8+ T >1,0 miało ładunki prowirusowe DNA HIV o wartości ,1000 kopii/mg genomowego DNA pochodzącego z komórek CD4+ T (P = .01; ryc. 1C).

Korelacja między częstością CTL swoistych dla HIV-1 a parametrami immunologicznymi i wirusologicznymi. Wykazano, że częstość CTL swoistych dla HIV-1 spada stopniowo po rozpoczęciu HAART u osób zakażonych HIV-1 z powodu zmniejszającej się dostępności antygenów HIV-1 . Zbadaliśmy zależność między częstością CTL specyficznych dla HIV-1 a stosunkiem komórek T CD4+:CD8+ u osób zakażonych, które skutecznie reagowały na HAART przez dłuższy czas. Nie stwierdzono statystycznie istotnej korelacji między częstością CTL reagujących na peptydy swoiste dla HIV pochodzące z genów gag, pol, env i nef a stosunkiem komórek T CD4+:CD8+ (ryc. 2). Ponadto, nie stwierdzono statystycznie istotnej korelacji pomiędzy liczbą CTL swoistych dla HIV a liczbą komórek T CD4+ i CD8+ oraz liczbą komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1 (dane nie pokazane). Warto zauważyć, że istniał trend w kierunku wyższej liczby CTL u osób z niższym stosunkiem komórek T CD4+:CD8+.

Dyskusje

Powszechne stosowanie HAART w leczeniu choroby HIV-1 doprowadziło do dramatycznej poprawy wyników klinicznych . Chociaż wiremia w osoczu może być utrzymywana poniżej granicy wykrywalności u wielu zakażonych osób otrzymujących HAART, utrzymywanie się niskich poziomów trwającej replikacji wirusowej w komórkach CD4+ T stanowiło główną przeszkodę w osiągnięciu eradykacji HIV-1 . Rzeczywiście, utrzymujące się niskie poziomy replikacji wirusowej są uważane za główny czynnik zaangażowany w utrzymanie rezerwuaru HIV-1, co znajduje odzwierciedlenie w częstotliwości komórek CD4+ T niosących prowirusowe DNA HIV-1 u pacjentów, u których wiremia w osoczu została zahamowana przez HAART do poziomu poniżej poziomu wykrywalności standardowych testów. Ponadto, utrzymujące się poziomy podwyższonej liczby komórek CD8+ T zostały zaobserwowane u dużej części zakażonych pacjentów otrzymujących HAART . W związku z tym zasugerowano, że aktywna replikacja wirusowa jest odpowiedzialna za podwyższone poziomy komórek T CD8+, a poziomy ekspresji markera aktywacji CD38 na tych komórkach okazały się być markerem prognostycznym progresji choroby w przypadku braku skutecznej terapii przeciwwirusowej.

Pomimo braku opublikowanych danych spekuluje się, że odwrócone proporcje komórek T CD4+:CD8+ we krwi obwodowej osób zakażonych, które są skutecznie leczone HAART, wynikają z niskiego poziomu trwającej replikacji wirusowej. W obecnym badaniu sprawdziliśmy, czy odwrócone proporcje komórek T CD4+:CD8+ u niektórych zakażonych osób otrzymujących HAART przez dłuższy czas były spowodowane niepełną supresją replikacji HIV-1, co odzwierciedla wielkość rezerwuaru prowirusowego DNA HIV-1 w komórkach T CD4+. Utrzymująca się obecność prowirusowego DNA HIV- 1 w przedziale komórek CD4+ T u zakażonych pacjentów otrzymujących HAART została przekonująco opisana w innym miejscu i uważano, że odzwierciedla niepełne zahamowanie resztkowej, trwającej replikacji wirusowej, pomimo supresji wiremii w osoczu do niewykrywalnych poziomów. Wykazaliśmy silną odwrotną korelację między częstością zakażonych komórek T CD4+ zawierających prowirusowe DNA HIV-1 a stosunkami komórek T CD4+ i CD8+, sugerując, że niskie poziomy resztkowej replikacji wirusowej mogły być częściowo odpowiedzialne za nieprawidłowe stosunki komórek T CD4+:CD8+ we krwi obwodowej.

Chociaż częstość komórek T CD4+ niosących prowirusowe DNA HIV-1 może być bezpośrednio związana ze stosunkami komórek T CD4+:CD8+, inne czynniki mogą wpływać na ten związek. Parametry takie jak istnienie nieznanych rezerwuarów wirusa, które podtrzymują aktywną replikację wirusa w obecności HAART, nieprawidłowości w układzie immunologicznym gospodarza, siła działania danego schematu terapeutycznego lub inne czynniki zakłócające mogą mieć wpływ zarówno na stosunek komórek CD4+: CD8+ T i prowirusowe ładunki DNA w przedziale komórek T CD4+. Nasze dane sugerują, że trwająca replikacja wirusowa na poziomach, które nie są wykrywalne przez standardowe testy dla wiremii osoczowej, ale które utrzymują rezerwuar komórek T CD4+ HIV-1, chociaż wystarczające do utrudnienia normalizacji stosunków komórek CD4+: CD8+ T u pacjentów badanych w tym badaniu, nie są wystarczające do utrzymania odpowiedzi CTL swoistych dla HIV-1.

Można argumentować, że utrzymujące się nieprawidłowe stosunki komórek T CD4+:CD8+ u zakażonych osób otrzymujących HAART przez dłuższy czas można również przypisać zarówno czynnikom immunologicznym, jak i wirusologicznym. W tym względzie wykazano, że przy braku progresji choroby i wystarczającej regeneracji komórek T CD4+, całkowita homeostaza komórek T jest utrzymywana u osób zakażonych przez podwyższone poziomy komórek T CD8+, które z kolei mogą zakłócać regenerację komórek T CD4+ . Nie znaleźliśmy jednak korelacji między poziomami komórek CD4+ T niosących prowirusowe DNA HIV-1 a liczbą komórek CD8+ T.

Wreszcie, poprzednie badania wykazały, że generowanie komórek CD4+ T w grasicy jest poważnie utrudnione przez bezpośrednie lub pośrednie konsekwencje aktywnej replikacji wirusowej. W tym względzie u osób zakażonych wykazano obniżone poziomy wyjścia grasicy, mierzone częstotliwością naiwnych komórek CD4+ T niosących kręgi wycięcia receptorów komórek T. (T cell receptor-rearrangement excision circles). Chociaż nie jest jasne, czy prekursory komórek T CD4+ są zakażane przez HIV-1 w grasicy, nasze dane silnie sugerują, że niepełna supresja replikacji wirusowej u zakażonych osób otrzymujących HAART nadal rozprzestrzenia infekcję w przedziale komórek T CD4+ we krwi obwodowej, powodując utrzymanie rezerwuaru komórek T CD4+ dla HIV-1.

Podziękowania

Dziękujemy Paulowi Parksowi za zaplanowanie wizyt pacjentów, Susan Moir za przeczytanie tego manuskryptu i za pomocne dyskusje, a także pacjentom za ich udział w tym badaniu.