Od czasu przełomowych odkryć podstawowych zasad leżących u podstaw klonowania molekularnego, opracowano wiele strategii klonowania w celu zwiększenia łatwości i szybkości rekombinacji fragmentów DNA. Przeczytaj o najbardziej powszechnych strategiach stosowanych w klonowaniu molekularnym lub uzyskaj swój pożądany gen w żądanym wektorze w prosty sposób dzięki klonom GenEZ™ ORF. Zacznij od wyszukania swojego genu.
Klonowanie tradycyjne
Klonowanie tradycyjne, zwane również klonowaniem PCR, wymaga użycia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) do amplifikacji sekwencji szablonu zainteresowania (zwykle genu zainteresowania) i dodania miejsc restrykcyjnych do końców sekwencji. Enzymy restrykcyjne są używane do cięcia zarówno szablonu zainteresowania, jak i wektora docelowego, a ligaza DNA jest używana do łączenia lepkich końców szablonu i wektora razem. Tradycyjne klonowanie pozwala na swobodną manipulację sekwencją DNA, co ułatwia tworzenie niemal dowolnych konstrukcji. Jednakże punkty kontrolne i procedury optymalizacji wymagane w klonowaniu tradycyjnym mogą być uciążliwe, a wymagane odczynniki mogą być drogie.
klonowanieTA
klonowanieTA jest jedną z najprostszych form klonowania. W tej metodzie wektory zawierające 5′ nawisy tyminowe są używane do akceptacji produktów PCR, w których dodatkowe 3′ nawisy adenozyny zostały dodane przez naturę amplifikacji polimerazy TAQ. Zaletą klonowania TA jest łatwość i szybkość, ponieważ nie jest wymagany etap trawienia restrykcyjnego. Ponadto, zestawy do klonowania TA zawierają bufory reakcyjne, które zawierają wstępnie wymieszany wektor, ligazę i bufor, co skraca czas reakcji ligacji do zaledwie 5 minut. Wadą technologii klonowania TA jest to, że klonowanie nie jest kierunkowe, co oznacza, że interesujący nas gen może być wprowadzony do wektora docelowego w orientacji sensownej lub antysensownej. Zazwyczaj połowa kolejnych transformantów będzie zawierała gen w kierunku sensownym, a połowa w kierunku antysensownym. Jednakże, komórki transformowane z genami toksycznymi mogą zawierać wszystkie geny w kierunku antysensownym, ponieważ komórki zawierające geny skierowane w kierunku sensownym nie przeżyją. Ponadto, komórki, które przeżyły, zawierające toksyczne geny zorientowane w kierunku sensownym, mogą być zmutowane w celu kodowania mniej toksycznego białka.
Klonowanie bezszwowe
Technologie klonowania bezszwowego eliminują wymóg stosowania enzymów restrykcyjnych. Może to być korzystne, gdy insert zawiera wiele miejsc restrykcyjnych w swojej sekwencji, co sprawia, że trudno jest zidentyfikować enzymy restrykcyjne, które nie przetną interesującego nas genu podczas procedury klonowania. Klonowanie bezszwowe wykorzystuje rekombinację homologiczną i istnieje wiele odmian tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, procedura polega na dodaniu sekwencji o długości około 15 bp do insertu i wektora za pomocą PCR. Egzonukleazy są używane do przeżuwania sekwencji insertu i wektora, a DNA jest łączone przy użyciu enzymów rekombinazowych lub ligazy DNA. Bezproblemowe klonowanie zostało uproszczone dzięki opracowaniu zestawów, które zawierają już wektor docelowy i opatentowaną mieszankę enzymów potrzebnych do reakcji rekombinacji. Na przykład zestaw GenBuilder™ firmy GenScript może klonować inserty o wielkości do 10 kb w ciągu 30 minut i może być również wykorzystywany w projektach klonowania o dużej wydajności.
.