Struktura roztworu, specyficzności glikanu i aktywności hamującej oksydazę fenolową lektyn typu C Anopheles CTL4 i CTLMA2

Conservation of CTL4/CTLMA2 in Anopheles

CTL4 i CTLMA2 składają się z peptydu sygnałowego, krótkiej N-końcowej sekwencji zawierającej motyw CXCXC i pojedynczej domeny CTL. Ostatnie doniesienie sugeruje, że funkcje CTL4 i CTLMA2 lub ich kofaktorów różniły się w obrębie Anopheles, a w szczególności, że CTL4 An. albimanus nie zawiera N-końcowych reszt cysteinowych zaangażowanych w wiązania disulfidowe22. Najpierw ponownie zbadaliśmy ortologów CTL4 (AGAP005335) i CTLMA2 (AGAP005334), które mają bliską orientację back-to-back na chromosomie 2L (ryc. 1a), używając aktualnych modeli genów (stan na luty 2019) w Vectorbase24. Znaleźliśmy białka z N-końcowym motywem CXCXC dla 15/16 ortologów CTL4, w tym An. albimanus AALB014534, i 13/14 ortologów CTLMA2. Przeprowadziliśmy wielokrotne dopasowanie sekwencji CTL4 i CTLMA2 z 10 gatunków Anopheles z Azji, Afryki i Nowego Świata (Rys. 1b). Nieukorzenione drzewa filogenetyczne mają prawie identyczną topologię, a połączone drzewo filogenetyczne ma dwie symetryczne gałęzie, z wyjątkiem pozycji An. dirus w stosunku do An. funestus i An. maculatus.

To wspiera hipotezę, że CTL4 i CTLMA2 są konserwowane w obrębie rodzaju Anopheles, z brakującymi ortologiami odzwierciedlającymi niekompletną anotację niektórych genomów. Zbadaliśmy region genomu trzech gatunków z odnotowanym ortologiem CTL4, ale bez ortologa CTLMA2: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, i An. melas AMEC014491. Wszystkie posiadają bliskie lub nakładające się geny w odwrotnej orientacji – ASTE002636, AMIN007379 i AMEC088499, zawierające dwie domeny CTL. U An. stephensi i An. minimus druga domena CTL poprzedzona jest motywem CXCXC, co sugeruje, że mogą to być ortologi CTLMA2. U komarów Aedes i Culex sytuacja jest mniej jasna. Ortolog CTLMA2 zawierający N-końcowy motyw CXCXC jest anotowany u Ae. albopictus, AALF001196, i ma bliski gen odwróconego back-to-back dwueksonu AALF001195, składający się z proteazy serynowej i domeny CTL. Model genów z października 2018 r. dla Ae. aegypti obejmuje ortolog CTLMA2 z N-końcowym motywem CXCXC, CTLMA14 (AAEL014382), obecnie wymieniony jako ortolog CTL4). Ortolog CTLMA2 jest odnotowany u C. quinquefasciatus, CPIJ000443, ale brak mu N-końcowego motywu CXCXC. Sugeruje to, że CTLMA2 powstał u wspólnego przodka Anopheles i Aedes, podczas gdy CTL4 może być specyficzny dla Anopheles.

Charakterystyka biochemiczna

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 i CTLMA2 CRDs (ryc. S1a) oraz An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, ryc. S1b) uległy ekspresji w komórkach owadzich przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusów (BEVS) i oczyszczono je do homogenności. Dojrzała AgCTL4 (25-177) ma masę molową 17,3 kDa i pI 7,7. Dojrzały AgCTLMA2 (18-174) ma masę molową 17,9 kDa i pI 4,5. Oczyszczony heterodimer ma masę cząsteczkową w nieredukującej (NR) SDS-PAGE 35 kDa (Rys. 2a) i eluuje jako pojedynczy pik w chromatografii z wykluczeniem rozmiaru (SEC) o pozornej masie cząsteczkowej 40 kDa (Rys. 2b). Monomeryczne CTL4 i CTLMA2 pojawiają się na redukującej SDS-PAGE odpowiednio przy 17 kDa i 20 kDa. Jak wcześniej zauważono, zwiększona pozorna masa cząsteczkowa CTLMA2 może odzwierciedlać jego nietypowy (kwaśny) rozkład aminokwasów20.

Wykazano, że CTL4/CTLMA2 An. gambiae jest stabilizowana przez międzycząsteczkowy disulfid pomiędzy cysteinami N-końcowego motywu CXCXC; mutacja tych trzech cystein do alaniny znosi tworzenie disulfidu między łańcuchami20. Aby dokładniej określić lokalizację disulfidu międzyłańcuchowego, skonstruowaliśmy dziewięć mutantów zawierających pojedynczą cysteinę w N-końcowym motywie CXCXC CTL4 i CTLMA2, współekspresjonowaliśmy białka w komórkach Sf9 i przeprowadziliśmy Western Blotting w celu wykrycia CTL4 i CTLMA2. Międzycząsteczkowe tworzenie disulfidów było nieefektywne, ale widoczne na nieredukującej SDS-PAGE we wszystkich przypadkach (ryc. 2c).

To sugeruje, że N-końcowe międzycząsteczkowe tworzenie disulfidów między CTL4 i CTLMA2 jest promiscuous, a nie angażuje specyficzną resztę cysteiny z każdego białka. Jeśli międzycząsteczkowe tworzenie disulfidów jest promiscuous, heterodimery CTL4/CTLMA2 mogłyby w zasadzie tworzyć wielowartościowe oligomery połączone disulfidami. Jednakże, na NR-SDS-PAGE nie wykryto żadnych oligomerów połączonych disiarczkami dla CTL4/CTLMA2 An. gambiae (Rys. 2a). Podobnie, podczas gdy CTL4 i CTLMA2 mogą tworzyć homodimery połączone wiązaniami disiarczkowymi in vitro20, oczyszczony produkt jest w przeważającej mierze (>95%) heterodimerem. Niektóre niewielkie paski (~10%) obserwuje się na NR-SDS-PAGE dla An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Rys. S1b), które mogą reprezentować tworzenie homodimeru lub oligomeru.

Zarówno An. gambiae CTL4/CTLMA2 i An. albimanus CTL4/CTLMA2 są polidyspersyjne w roztworze. Niekowalencyjna oligomeryzacja wyższego rzędu jest widoczna jako ramię głównego piku w SEC wraz ze wzrostem stężenia i jest bardziej wyraźna dla An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Rys. S1). Potwierdziliśmy istnienie oligomerycznych gatunków przez analityczne ultrawirowanie z prędkością sedymentacji (AUC) (Fig. 2d). Przy pH 7,5 obserwuje się serię gatunków o malejącej intensywności w rozkładzie c(s): s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomeryzacja jest niezależna od Ca2+ dla A. gambiae CTL4/CTLMA2, ale wzrasta znacząco z Ca2+ dla A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Rys. S1b), i nie jest skorelowana z pH według dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Rys. 2e).

Wiązanie wapnia

Jako CTL, zarówno CTL4 jak i CTLMA2 mogą wiązać wapń. Jednakże, kanoniczne reszty wiążące Ca2+ w CTL4 są zmutowane, co sugeruje, że może to być CTLD, ale nie CRD typu C. Dlatego też zmierzyliśmy powinowactwo wiązania wapnia przez CTL4 An. gambiae, CTLMA2 oraz heterodimer CTL4/CTLMA2 An. gambiae i An. albimanus za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). W równorzędnych warunkach wiązanie obserwowano dla CTLMA2 i CTL4/CTLMA2, ale nie dla CTL4 (ryc. 3a-c). Stałe wiązania i parametry termodynamiczne obliczono na podstawie wyników trzech niezależnych eksperymentów (Tabela 1). Wiązanie CTLMA2 z Ca2+ jest dobrze dopasowane przez model pojedynczego miejsca wiązania z KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. Powinowactwo An. gambiae CTL4/CTLMA2 do wapnia jest ~40 × wyższe niż CTLMA2 z KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (ryc. 3d) ma podobne powinowactwo do wapnia z KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Jednakże, wiązanie wapnia zarówno do An. gambiae jak i An. albimanus CTL4/CTLMA2 było sub-stoichiometryczne (N = 0,36-0,50).

Wiązanie z glikanem

CTL4 i CTLMA2 należą do linii mieloidalnych CTL – w tym makrofagowego receptora mannozy (MMR) i DC-SIGN – które tworzą konserwowaną rodzinę receptorów immunologicznych u metazoanów15,25. Spośród CTL o znanej strukturze, CTLMA2 wykazuje 30% identyczność sekwencji z domeną rozpoznawania węglowodanów (CRD) mysiego receptora scavengera (SCRL, PDB ID 2OX9)26 i świńskiego białka surfaktantu D (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 zachowuje reszty związane z wiązaniem Ca2+ w pętli wiążącej glikany oraz kanoniczny motyw EPN związany z selektywnością D-mannozy (Rys. 4a). Natomiast w CTL4 brak jest wszystkich reszt związanych z wiązaniem Ca2+, co jest zgodne z faktem, że nie zaobserwowano wiązania za pomocą ITC. Jedynym znanym CTL o strukturze znacznie podobnej do CTL4 jest białko wiążące czynnik IX/X (X-bp) z jadu mokasyna chińskiego Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp jest zmodyfikowanym CTLD, w którym domena wiążąca glikany jest zastąpiona długą pętlą, która pośredniczy w dimeryzacji w celu wytworzenia miejsca wiążącego czynnik IX/X. Stąd, chociaż niektóre owadzie CTL nie wymagają wapnia do wiązania glikanów, nie jest jasne, czy CTL4 powinien w ogóle wiązać glikany.

W celu określenia ich aktywności lektynowej, analizowaliśmy CTL4, CTLMA2 i heterodimer CTL4/CTLMA2 na tablicach glikanów, które wyświetlają 367 unikalnych struktur glikanów28. Badania te wykazały wiązanie do szeregu glikanów (Tabela 2). Monomery CTL4 i CTLMA2 wykazywały wiązanie odpowiednio tylko do czterech i sześciu glikanów, podczas gdy heterodimer wiązał 18 różnych glikanów. Istnieje wyraźna różnica między ligandami wiązanymi przez poszczególne monomery i heterodimer; 3/4 (75%) glikanów rozpoznawanych przez CTL4 i 2/6 (33%) glikanów rozpoznawanych przez CTLMA2 nie było rozpoznawanych przez CTL4/CTLMA2.

W celu potwierdzenia wyników macierzy glikanów oraz określenia preferencji wiązania dla CTL wykonano analizę SPR (Tabela 3). W prawie wszystkich interakcjach tablica glikanowa i SPR zgadzały się co do obecności interakcji, przy czym SPR wskazywała, że tablica glikanowa miała cztery wyniki fałszywie ujemne: CTLMA2 monomer z antygenem H, siarczanem chondroityny i chondroityno-6-siarczanem oraz CTL4 monomer z chondroityno-6-siarczanem. Jednak wszystkie wyniki fałszywie ujemne wykazały wiązanie na tablicy z heterodimerem CTL4/CTLMA2.

CTL nie rozpoznały glikanów zawierających mannozę, z wyjątkiem mannozy-6-fosforanu przez CTL4/CTLMA2, pomimo kanonicznego motywu EPN obecnego w CTLMA2. Rozpoznawane struktury są raczej ogólnie motywami glikozaminoglikanów (GAG) obejmującymi wiązania β1-3/β1-4 pomiędzy glukozą (Glc), galaktozą (Gal) i ich odpowiednimi heksozaminami GlcNac i GalNac. Wiązanie Galβ1-4Glc było obecne w 12/23 (52%) rozpoznanych glikanów, w tym 6/23 (26%) zawierających Galβ1-4GlcNac i 4/23 (17%) zawierających motyw keratanowy Galβ1-4GlcNac β1-3Gal lub GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

Macierz wykazywała również pewną preferencję dla glikanów polimerycznych i siarczanowych. Spośród czterech glikanów rozpoznawanych przez CTL4, najsilniejsze trafienie dotyczyło globopentazy (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 wiązał również HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n i β1-3Glukan (Glcβ1-4Glc)n. Trzy z pięciu glikanów rozpoznawanych przez monomer CTLMA2 były siarczanowane, a heterodimer CTL4/CTLMA2 rozpoznawał siarczan chondroityny i siarczan chondroityny-6, kwas hialuronowy (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 i HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Wyniki te sugerują istnienie odrębnych i synergistycznych efektów heterodimeryzacji na wiązanie glikanów.

Zarówno CTLMA2, jak i heterodimer CTL4/CTLMA2 rozpoznaje kilka cukrów zawierających fukozę, w tym sialyl-LewisX i sulfo-LewisA, ale nie sialyl-LewisA. Najwyższe powinowactwo wiązania zaobserwowano do sulfo-LewisA, przy czym wiązanie do kompleksu CTLMA2 (106 nM) i CTL4/CTLMA2 (95 nM) miało KD ~100 nM (Tabela 3). Najwyższe powinowactwo wiązania zaobserwowane dla CTL4 było również do sulfowanego glikanu, sulfo-laktozaminy (292 nM).

Analiza strukturalna

Aby dokładniej zbadać strukturę CTL4 i CTLMA2, wygenerowaliśmy modele strukturalne CTL4 i CTLMA2 (ryc. 4b) za pomocą MODELLER29 z dodatkową ręczną edycją. Zarówno CTL4, jak i CTLMA2 mają przedłużoną pętlę (pętla 1) następującą po drugiej helisie CTLD (Ryc. 4a) z dużą gęstością komplementarnie naładowanych reszt; reszt zasadowych dla CTL4 i reszt kwasowych dla CTLMA2. Komplementarna elektrostatyka tych reszt pętli 1 i ich bliskość do N-końcowego motywu CXCXC sugeruje, że jest to potencjalny interfejs białko-białko w obrębie heterodimeru (Rys. 4b), dla którego wygenerowano hipotetyczny model z pojedynczym wiązaniem disiarczkowym w motywie CXCXC. Pętle wiążące glikan/Ca2+ stanowią jednak drugi potencjalny interfejs, jak zaobserwowano w przypadku dwóch łańcuchów X-bp D. acutus. Alternatywną hipotezą jest to, że dwie domeny CTL są niezależne od siebie, z elastycznymi łącznikami łączącymi je poprzez hipotezę międzycząsteczkową.

Aby przetestować tę hipotezę, przeanalizowaliśmy strukturę roztworu CTL4/CTLMA2 za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS). Eksperymenty przeprowadzono w 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 i 1% glicerolu, aby zminimalizować oddziaływania międzycząsteczkowe. W tych warunkach białko wykazywało liniową zależność pomiędzy ekstrapolowaną intensywnością przy zerowym kącie a stężeniem (I0 vs. c) aż do stężenia 3,1 mg/ml. Odjęta od buforu krzywa intensywności I vs. q (Rys. 4c) została poddana SAXSMoW2 , co dało wynik RG = 23.0 Å (I0 = 0.61) i masę cząsteczkową MW = 39 kDa, tylko 11% większą niż oczekiwana masa cząsteczkowa heterodimeru 35 kDa30. Jednakże, obliczony wykres Guiniera oparty jest tylko na siedmiu punktach danych; dopasowanie w rozszerzonym zakresie (Rys. 4c, wstawka) daje RG = 24.5 Å (I0 = 0.64), podczas gdy dopasowanie funkcji rozkładu parami P(r) (Rys. 4d) daje RG = 25.4 Å (I0 = 0.65). Rozkład P(r) dopasowany przez DAMMIF31 do 20 modeli ab initio paciorków ze średnią znormalizowaną rozbieżnością strukturalną NSD = 1.0 ± 0.2. Główny korpus modeli ab initio ma kształt podobny do oczekiwanego heterodimeru CTL4/CTLMA2.

Dodatkowa gęstość rozciąga się od głównego korpusu modeli paciorkowych, która może odzwierciedlać albo N-końcową sekwencję obu białek, w tym motyw CXCXC, albo mniejszą populację CTL4/CTLMA2 o większym promieniu gyration. Aby sprawdzić tę hipotezę przeprowadziliśmy wielostanowe modelowanie profilu SAXS za pomocą programu MULTIFOXS32. Wygenerowaliśmy kompletny model dla CTL4-6xHis/CTLMA2 z N-końcową cewką zakończoną międzycząsteczkowym disulfidem pomiędzy CTL4 C39 i CTLMA2 C34. MULTIFOXS wygenerował zespół 10,000 wariantów modelu do porównania z eksperymentalną krzywą rozpraszania. Jedynymi elastycznymi resztami były reszty CTL4 40-45 i 178-183 (6xHis) oraz CTLMA2 35-39, przy czym N-końcowa cewka służyła jako sztywne ciało łączące oba łańcuchy. Najlepszy model jednostanowy pasował do danych z χ2 = 1,13 i miał RG = 23,7 Å. Minimalne χ2 = 1,07 uzyskano dla modelu trójstanowego (Rys. 4e), w którym 80% rozpraszania pochodzi z dwóch zwartych modeli z RG = 22,0 Å i RG = 23,7 Å. Dane te są zgodne z tworzeniem zwartego heterodimeru między CTL4 i CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 hamują aktywację oksydazy fenolowej w odpowiedzi na E. coli

CTL4 i CTLMA2 funkcjonują jako inhibitory odpowiedzi melanizacji komara na infekcję. Wcześniej donoszono, że knockdown CTL4 nie prowadził do zwiększenia aktywności oksydazy fenolowej (PO) w odpowiedzi na zakażenie mieszaniną E. coli i S. aureus20. W tym samym badaniu stwierdzono jednak, że komary dsCTL4 i dsCTLMA2 były szczególnie wrażliwe na bakterie Gram-ujemne. Dlatego też ponownie zbadaliśmy wpływ knockdownu CTL4 i CTLMA2 na aktywność PO w hemolimfie w odpowiedzi tylko na infekcję E. coli (Rys. 5a). W 4 h po infekcji E. coli, aktywność PO była znacząco zwiększona dla komarów dsCTL4 (p = 0,02) i dsCTLMA2 (p = 0,004) w porównaniu do kontroli dsLacZ (Rys. 5b). Średnia wydajność knockdown dla CTL4 i CTLMA2 wynosiła odpowiednio 93 ± 3% i 89 ± 3%, z >80% w każdym pojedynczym eksperymencie.

Melanizacja ookinet Plasmodium po wyciszeniu CTL4/CTLMA2 jest zależna od LRIM117,22, TEP133 i SPCLIP133. Ponieważ wszystkie te elementy są elementami podobnej do dopełniacza odpowiedzi immunologicznej TEP1, uznaliśmy, że zwiększona aktywność PO przy braku CTL4 powinna być zależna od TEP1. Odpowiednio, porównaliśmy wzmocnienie aktywności PO u komarów dsCTL4 z jednoczesnym podawaniem dsTEP1 do jednoczesnego podawania dsLacZ (Fig. 5c). Średnia skuteczność knockdown dla TEP1 wynosiła 82 ± 9% i >80% w 5/6 eksperymentach (64% w jednym eksperymencie). Rzeczywiście, nie zaobserwowano znaczącego zwiększenia aktywności PO u komarów dsCTL4, gdy TEP1 był również wyciszony. Potwierdza to, że melanizacja przy braku CTL4/CTLMA2 jest zależna od TEP1.

Koadministracja rekombinowanego CTL4/CTLMA2 z E. coli znacząco odwróciła wzrost aktywności PO u komarów dsCTL4 w porównaniu do BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Wyniki te pokazują, że CTL4/CTLMA2 jest bezpośrednio zaangażowany jako negatywny regulator aktywności PO. Jednak u komarów dsLacZ, CTL4/CTLMA2 nie tłumiła aktywności PO indukowanej przez E. coli w porównaniu z surowiczą albuminą bydlęcą (BSA). Również aktywność PO wywołana przez E. coli u komarów dsCTL4, którym wstrzykiwano rekombinowane CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTLs) była wyższa niż u komarów dsLacZ, którym wstrzykiwano BSA (dsLacZ + BSA). Stąd, wstrzyknięcie rekombinowanego CTL4/CTLMA2 nie ratuje całkowicie utraty endogennego białka.