June 1, 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Założycielka i główna autorka DeeAnn Visk Consulting
Terapia genowa musi przełamać obwarowania komórkowe bez odtwarzania upadku Jerycha w miniaturze
Immunoterapie przeciwko nowotworom, szczepionki przeciwko nowym wirusom (lub starym wirusom w nowych miejscach), oraz próby rozwiązania patogennych defektów pojedynczych komórek – wszystkie dążą do włączenia technologii transfekcji. Technologia ta, obejmująca różne sposoby wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek, jest bardzo obiecująca, ale stawia też poważne wyzwania.
Wyzwania te były najbardziej widoczne w próbach zastosowania terapii genowej, która z trudem radziła sobie z problemem trudnych do transfekcji komórek, organów i całych zwierząt.
Takie wyzwania związane z transfekcją zostały podjęte przez kilka firm biotechnologicznych. Na przykład, MaxCyte, Lonza i Mirus Bio oferują elektroporację jako metodę, która pozostawia po sobie niewiele pozostałości. Tak się jednak składa, że elektroporacja nie nadaje się do stosowania u wszystkich zwierząt, dlatego potrzebne są inne metody. Jedną z alternatywnych technik jest infekcja wirusowa. Jest ona stosowana przez firmy takie jak GenVec.
Innym wyzwaniem, szczególnie istotnym dla wirusowej transfekcji, jest możliwość stymulowania odpowiedzi immunologicznej. Ten potencjalny negatyw może być prawdziwym pozytywem, jednakże we właściwym kontekście, którym jest rozwój szczepionek. Firma Thermo Fisher Scientific specjalizuje się w wykorzystywaniu metod transfekcji wirusowej do wspomagania mechanizmów szczepień. Firma ta oferuje również tradycyjną, opartą na chemii transfekcję, która działa na całym zwierzęciu.
W sumie, firmy wymienione do tej pory oferują technologie, które obejmują wszystkie główne tryby terapeutycznie istotnej transfekcji: transfekcję opartą na chemii, metody niechemiczne (głównie elektroporację) i transdukcję wirusową. Opracowywane są również metody hybrydowe, co zostanie wyjaśnione w kolejnych rozdziałach.
Elektroporacja
Platforma elektroporacyjna firmy MaxCyte jest zgodna z GMP i bezproblemowo skalowalna od badań do skali komercyjnej. „Nasz system elektroporacji przepływowej umożliwia transfekcję od miliona do kilkuset miliardów komórek w czasie krótszym niż 30 minut w całkowicie zautomatyzowanym systemie zamkniętym,” wyjaśnia Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. „Nasz system jest zgodny z normami ISO 9000 i FDA, więc może z łatwością zaspokoić potrzeby produkcji na poziomie terapeutycznym.
„Rutynowo współpracujemy z firmami farmaceutycznymi i biotechnologicznymi w celu opracowania terapii ex vivo z wykorzystaniem komórek odpornościowych i macierzystych. Czasami celem jest szybka produkcja szczepionek i wysokowydajnych leków biologicznych, takich jak przeciwciała. W innych przypadkach umożliwiamy klientom produkcję na dużą skalę wektorów wirusowych o wysokiej miareczkowości przy użyciu komórek zawieszonych i przylegających. Nie tylko pomaga to w rozwoju terapii, ale może również przyspieszyć odkrywanie leków.”
Ta zdolność do przetwarzania komórek w dużych lub małych ilościach pozwala naukowcom z laboratorium opracować protokół procesu wykorzystujący elektroporację przepływową dla małych ilości komórek. Skalowanie tego procesu odbywa się bezproblemowo, bez konieczności utrzymywania jakości, ponieważ proces transfekcji pozostaje taki sam.
„Ta redukcja ryzyka jest bardzo atrakcyjna dla naszych partnerów. Zapewnienie spójności od badań, do kliniki, do skali komercyjnej i od serii do serii, od dawcy do dawcy i od pacjenta do pacjenta jest krytyczne dla efektywnego prowadzenia terapii przez proces rozwoju” – zapewnia dr Peshwa.
Podejścia chemiczne i lipidowe sprawdzają się w badaniach z ustalonymi liniami komórkowymi, ale często występują nieprzewidziane konsekwencje transfekcji komórek pierwotnych. Dodatkowo, te tradycyjne chemiczne sposoby transfekcji komórek są trudne do skalowania do produkcji przemysłowej.
Elektroporacja, niewirusowe podejście stosowane przez MaxCyte, pozwala na zachowanie biologii transfekowanych komórek w bardziej naturalnym stanie w każdej skali. Zapobiegając niezamierzonym konsekwencjom podczas procesu transfekcji, technologia MaxCyte może uniknąć tworzenia przeszkód, jednocześnie rozwiązując potrzebę wysokiej wydajności transfekcji.
„Te interwencje terapeutyczne muszą być praktycznie zagwarantowane, aby mieć minimalny niezamierzony negatywny wpływ na modyfikowane komórki – cała biologia musi być taka sama na każdym etapie procesu”, nalega dr Peshwa. „Ponadto, nasz system elektroporacji przepływowej może być stosowany w sposób zautomatyzowany. Jest on już rutynowo stosowany w Japonii do komercyjnych zabiegów terapeutycznych i znajduje się na różnych etapach wdrażania na całym świecie.”
Innym aspektem jest miejsce, w którym odbywa się transfekcja. Czy komórki pobrane od pacjenta są przewożone do innego miasta w celu przetworzenia? Co się stanie, gdy przesyłka zostanie zgubiona, opóźniona lub gdy wystąpią wahania temperatury? Platforma oferowana przez MaxCyte daje możliwość opracowywania nowych terapii poprzez przetwarzanie na miejscu komórek pacjenta, omijając główne problemy logistyczne i COGS (cost of goods sold) występujące w innych metodach.
Engineering komórek jest krytyczny dla rozwoju terapii opartych na komórkach. System elektroporacji firmy MaxCyte pozwala uniknąć niezamierzonej modyfikacji fenotypu komórek, spełniając jednocześnie kluczowe potrzeby związane z wyzwaniami inżynierii komórkowej: wydajność, spójność, przenośność i skalowalność, według firmy.
Transdukcje wirusowe
Wektory wirusowe są szczególnie przydatne do tranfekcji całych zwierząt lub do stosowania w tkankach, które mogą być trudno dostępne za pomocą metod chemicznych lub elektroporacji. GenVec specjalizuje się w wykorzystaniu wektorów wirusowych, szczególnie adenowirusów, do dostarczania genów do celów terapeutycznych.
„Na pierwszy rzut oka, problemy związane z odpowiedzią immunologiczną na wektory wirusowe wydają się być problematyczne,” wyjaśnia Doug Brough, Ph.D.. „Jednak odkryliśmy, że można to wykorzystać do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na obce materiały, dzięki czemu adenowirusy mogłyby być wykorzystywane do dostarczania szczepionek.”
I rzeczywiście, GenVec dokładnie zbadał adenowirusy i wygenerował kilka różnych „smaków” adenowirusów. Podczas badania adenowirusów u innych gatunków, takich jak goryle i małpy, badacze mogą używać wektorów, które zostały zaprojektowane tak, aby uniknąć istniejącej wcześniej odporności, jaką ogólna populacja ludzka ma na adenowirusy.
„Duża biblioteka wektorów oferowanych przez GenVec jest nazywana Adenoverse™”, informuje dr Brough. „Usunęliśmy duże fragmenty adenowirusa, aby ograniczyć wrodzoną toksyczność związaną z leczeniem adenowirusami. Oprócz zapobiegania szkodliwej odpowiedzi immunologicznej na wektor, pozwala nam to zmieścić do 12 kb w wirusie.”
Wykorzystując różnorodne podejścia, GenVec współpracował z wieloma firmami nad różnymi zastosowaniami, terapiami kwasami nukleinowymi i technologiami edycji genów. Zmodyfikowane adenowirusy mogą dostarczać podejścia palca cynkowego, zarówno in vitro, jak i in vivo.
Przykład jednej z takich współpracy znajduje się z próbą kliniczną Novartis w celu regeneracji komórek czuciowych w uchu wewnętrznym. „Poprzez zainfekowanie komórek w uchu wewnętrznym genem kodującym kluczowe białko regulacyjne, można wygenerować nowe komórki mechanosensoryczne w celu zastąpienia tych utraconych w wyniku urazu lub nieodłącznych warunków genetycznych”, wyjaśnia dr Brough.
Inne wspólne projekty można znaleźć z partnerstwami w podmiotach zajmujących się leczeniem raka i opracowywaniem szczepionek. „Kiedy przychodzi czas na komercjalizację technologii, GenVec wykorzystuje linię komórkową uprzednio zatwierdzoną przez FDA do tych zastosowań”, wyjaśnia dr Brough.
„Inną oczywistą zaletą stosowania adenowirusów jest to, że mogą one łatwo transfekować całe zwierzęta. Na przykład, wyniszczająca choroba zwierząt hodowlanych, zwana pryszczycą, jest wywoływana przez różne typy wirusa. Nasz system mógłby pozwolić na szybką wymianę szczepów wywołujących epidemię i umożliwić szybkie dostarczenie szczepionki dostosowanej do indywidualnych potrzeb” – opisuje dr Brough.
Nukleofekcja
Lonza oferuje zaawansowaną formę elektroporacji zwaną Nukleofekcją™, która wykorzystuje roztwory do transfekcji specyficzne dla danego typu komórek w połączeniu z bardziej zaawansowanym systemem dostarczania impulsów, który umożliwia transfekcję wielu różnych typów komórek, w szczególności normalnych pierwotnych komórek ludzkich.
„Zamiast stosować standardowe roztwory buforowe do elektroporacji, stosujemy roztwory do transfekcji specyficzne dla danego typu komórek” – mówi Gregory Alberts, Ph.D, Gregory Alberts, ekspert ds. zagadnień globalnych w firmie Lonza. „Pozwala nam to ustabilizować pory powstałe podczas dostarczania impulsów. Spekulujemy, że pory powstające w błonie komórkowej podczas standardowej elektroporacji szybko się zamykają. Nasza technologia stabilizuje pory powstałe podczas elektroporacji i pozwala na dyfuzję materiału do wnętrza komórki, a dokładniej do jej jądra.”
Podejście do nukleofekcji wykorzystuje wiele różnych substratów: DNA, mRNA, siRNA, peptydy, białka i małe cząsteczki. Wydajność transfekcji dla siRNA i mRNA jest bardzo dobra, lepsza niż 90%. Małe peptydy zwykle transfekują z wydajnością około 80%, a wydajność dla plazmidowego DNA wynosi od 50% do 90%, w zależności od typu komórki. Nawet duże substraty, większe białka, takie jak przeciwciała lub sztuczne chromosomy bakteryjne (BACs), mogą dostać się do komórek docelowych z rozsądną skutecznością transfekcji.
„Nukleofekcja jest zaskakująco elastyczna”, oświadcza dr Alberts. „Została użyta do transfekcji wszystkich rodzajów pierwotnych komórek ludzkich. Została wykorzystana w generowaniu iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych), transfekcji CRISPR i innych substratów do edycji genomu, jak również w transfekcji bardziej egzotycznych celów, takich jak rodzina pasożytów Plasmodium, które powodują malarię. Inne podobne organizmy mogą być również transfekowane za pomocą Nucleofection, aby umożliwić badania nad chorobami tropikalnymi.”
Platforma Nucleofection jest skalowalna. Na przykład, wysokowydajny system Nukleofection może obsługiwać formaty 96- i 384-dołkowe. Często system ten jest wykorzystywany w ośrodku badań przesiewowych. Naukowcy pracujący na stanowisku badawczym mogą używać Nukleofektora 4D o niższej wydajności do optymalizacji warunków badania. Ponieważ stacjonarny Nukleofektor 4D wykorzystuje te same warunki transfekcji, pracuje z taką samą liczbą komórek i zapewnia taką samą wydajność jak urządzenia o większej przepustowości, gdy nadchodzi czas przejścia na większą skalę, badanie nie wymaga ponownej optymalizacji.
„Ciągłość systemu pozwala na porównywanie jabłek do jabłek przy zwiększaniu lub zmniejszaniu skali projektu,” ilustruje Dr. Alberts.
„Jesteśmy w trakcie testów beta nowego urządzenia do transfekcji dużych objętości, które będzie w stanie transfekować od 200 milionów do 1 miliarda komórek w formacie od 1 do 20 mL. Wstępne wyniki pokazują, że urządzenie to transfekuje pierwotne komórki ludzkie lub linie komórkowe na tym samym poziomie, co inne urządzenia Lonza Nucleofector” – kontynuuje dr Alberts. „Produkt ten będzie przeznaczony wyłącznie do celów badawczych, chociaż ze względu na zdolność Nucleofection do tak dobrej transfekcji pierwotnych komórek ludzkich, niewątpliwie pojawi się zainteresowanie wykorzystaniem tego urządzenia w zastosowaniach bardziej zorientowanych klinicznie.”
Dr. Alberts przewiduje, że Nucleofection może odegrać rolę w innowacyjnych i spersonalizowanych terapiach nowotworowych, takich jak terapia chimerycznymi komórkami antygenowymi T (CAR-T), jak również w innych terapiach opartych na komórkach wymagających transfekcji lub modyfikacji genomowej pierwotnych komórek ludzkich.
„Zdolność Nucleofection do łatwej i skutecznej transfekcji pierwotnych ludzkich komórek T przyciągnie uwagę w podejściu do terapii genowej w leczeniu chorób. Podejście firmy Lonza do potencjalnych zastosowań w terapii genowej ma również bardzo małą powierzchnię. Jest to niezwykle istotne, ponieważ „resztki” maszyn z innych technik transfekcji mogą prowadzić do niezamierzonych konsekwencji biologicznych” – podsumowuje dr Alberts.
Naukowcy z firmy Lonza ocenili zdolność technologii Nucleofection do transfekcji zdysocjowanych dorosłych szczurzych komórek mięśni gładkich aorty (AoSMCs). Kriokonserwowane szczurze AoSMC zostały rozmrożone i hodowane przez siedem dni w 24-dołkowych płytkach hodowlanych, a następnie komórki zostały poddane transfekcji w warunkach przylegania przy użyciu roztworu AD1 4D-Nucleofector Y. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji komórki były utrwalane i analizowane. Aktynę pokazano na czerwono; GFP na zielono.
Formulacje
Mirus Bio opracowuje i produkuje nowe preparaty do transfekcji, które umożliwiają wysokowydajne i niskotoksyczne dostarczanie wielu różnych typów cząsteczek kwasów nukleinowych. Wiele z tych preparatów jest wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego. „Bez zwierząt” jest ważną cechą dla zastosowań przedklinicznych i klinicznych.
System CRISPR wymaga dostarczenia przewodniego RNA (gRNA) i ekspresji endonukleazy Cas9, która może być w postaci białka, mRNA lub DNA. Mirus Bio oferuje rozwiązania w zakresie transfekcji, które umożliwiają efektywne dostarczenie wszystkich różnych cząsteczek kodujących Cas9. Podczas stosowania chemicznych metod transfekcji do dostarczania białka Cas9, badacze mogą stosować znacznie niższe poziomy białka, jeśli jest ono wstępnie połączone z gRNA.
„Niektóre trudne do transfekcji typy komórek dają wyższą wydajność cięcia przy transfekcji białka Cas9 złożonego w kompleksie RNP (rybonukleoproteina),” stwierdza Laura Juckem, Ph.D., lider grupy R&D w Mirus Bio. „System dynamicznego dostarczania Mirus TransIT-X2® skutecznie dostarcza kompleksy RNP i pozwala na stosowanie niższych stężeń białka Cas9 w porównaniu z elektroporacją.”
Innym wyzwaniem stojącym przed firmami jest przejście z hodowli przylegających na hodowle zawiesinowe, aby pomieścić dużą ilość materiału potrzebnego do badań klinicznych. Dotyczy to w szczególności produkcji rekombinowanych lentiwirusów i wirusów adeno-asocjowanych (AAV). „Ściśle współpracujemy z naszymi klientami, aby upewnić się, że ich transfekcje są udane, a zmiany w przebiegu pracy nadal pozwalają uzyskać produkt wysokiej jakości” – wyjaśnia dr Juckem.
„W przypadku terapii opartej na komórkach system ekspresji CHO-gro® Expression System został opracowany w celu uzyskania wysokiej wydajności białek bioterapeutycznych w zawiesinie komórek CHO. Ten zoptymalizowany system promuje wzrost komórek o wysokiej gęstości i umożliwia badaczom uzyskanie wystarczającej ilości białka do przeprowadzenia badań przedklinicznych i wstępnych analiz charakterystyki” – podsumowuje dr Juckem.
Ten obraz, pochodzący z prezentacji firmy Mirus Bio opisującej wysokowydajną transfekcję komórek macierzystych, wskazuje, że komórki somatyczne, takie jak dorosłe komórki fibroblastów, mogą być poddawane transfekcji lub transdukcji za pomocą kilku metod z wykorzystaniem kombinacji czynników transkrypcyjnych. Po przeprogramowaniu komórek do stanu pluripotencjalnego, mogą być one kierowane do różnych losów poprzez dodanie czynnika wzrostu i/lub transfekcję markerów selekcyjnych napędzanych przez promotory specyficzne dla danego typu komórki. Obraz podkreśla, że odczynniki do transfekcji mogą być dodawane do procesu pracy z komórkami macierzystymi w kilku punktach.
Podejście do całych zwierząt
Thermo Fisher Scientific jest na bieżąco z potrzebami klientów w zakresie generowania bardziej istotnych biologicznie danych przy użyciu komórek pierwotnych, a nie unieśmiertelnionych linii komórkowych. Komórki pierwotne są tradycyjnie trudniejsze do transfekcji metodami chemicznymi. Jednakże dane generowane z pierwotnych hodowli komórkowych dostarczają odpowiedzi, które lepiej przekładają się na modele in vivo na całych zwierzętach.
Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych, które dają bardziej trafne wyniki niż dwuwymiarowe hodowle komórkowe, są trudniejsze do transfekcji tradycyjnymi metodami.
„Transfekcja pierwotnych hodowli DNA stanowi wyzwanie. Użycie siRNA (mały hamujący kwas rybonukleinowy), mRNA (messenger RNA) i białka bezpośrednio jest łatwiej akceptowane przez komórki pierwotne, ponieważ związki te muszą być dostarczane tylko do cytoplazmy, a nie do jądra komórkowego”, stwierdza Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D., Ponieważ komórki pierwotne nie dzielą się tak łatwo jak linie komórkowe, możemy obejść ten problem, dostarczając cząsteczki do cytoplazmy, a nie do jądra.”
Kontynuując poszukiwania bardziej biologicznie istotnych systemów w całych zwierzętach, „odkryliśmy, że zastosowanie Invivofectamine® 3.0 in vivo może skutecznie zmniejszyć ekspresję białka o 90% w komórkach wątroby”, mówi dr de Mollerat. „To zastosowanie in vivo Invivofectamine daje naukowcom bardziej efektywny model tego, jak wygląda leczenie w całym zwierzęciu.”
Innym zastosowaniem technologii transfekcji jest rozwój szczepionek. Czas opracowywania szczepionek może zostać znacznie skrócony dzięki wykorzystaniu transfekowanego mRNA do ekspresji antygenów, przeciwko którym organizm może rozwinąć odpowiedź immunologiczną. Biorąc pod uwagę liczbę nowych wirusów występujących na świecie, takich jak Zika i chikungunya, możliwość szybkiego opracowania szczepionek znacznie poprawi stan zdrowia na świecie.
W związku z ciągłym rozwojem terapii immunologicznych ukierunkowanych na nowotwory, limfocyty T są często namierzane za pomocą określonych receptorów. „Współpracowaliśmy z firmami zainteresowanymi rozwojem tych terapii” – wyjaśnia dr de Mollerat. „Ściśle współpracujemy z firmami, aby odpowiedzieć na pytania, jak wyprodukować te terapie, wykonać je na dużą skalę i udostępnić na całym świecie.”
Invivofectamine 3.0 jest odczynnikiem dostarczonym przez Thermo Fisher Scientific do dostarczania RNAi in vivo. Według firmy, pojedyncza iniekcja powoduje znaczny knockdown w 1. dniu i do 3 tygodni. Odkrycie to pochodzi z badania, w którym odczynnik wstrzykiwano w ogon gryzonia w różnych dawkach (1, 0,5 i 0,25 mg/kg). Surowica była pobierana w dniach 2, 5, 9, 16, 23 i 30, a surowica była analizowana pod kątem zmniejszenia stężenia białka FVII za pomocą testu chromogenicznego. Firma zauważyła, że większe ilości siRNA we wstrzykniętych kompleksach skutkowały dłuższym czasem trwania knockdownu w badanym zakresie.