1 Wprowadzenie
składanie i stabilność tRNA jest kluczowa dla wydajnej translacji, a defekty w każdej z tych właściwości mogą prowadzić do zmniejszenia ilości tRNA, co skutkuje defektami wzrostu u drożdży i chorobami u ludzi (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). U drożdży Saccharomyces cerevisiae znane są dwa główne szlaki komórkowej kontroli jakości, których zadaniem jest degradacja wadliwych gatunków tRNA. Pierwszym szlakiem jest szlak nadzoru jądrowego, który działa na pre-tRNA w jądrze poprzez wykorzystanie egzosomu jądrowego i kompleksu TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova i in., 2005), degradując pre-tRNAiMet pozbawione modyfikacji m1A58 lub z nieprawidłowo przetworzonym 3′ przyczepem (Ozanick i in., 2009) oraz frakcję pre-tRNA typu dzikiego (WT) (Gudipati i in., 2012). Drugim szlakiem jest szlak szybkiego rozpadu tRNA (RTD), który degraduje specyficzne dojrzałe, hipomodyfikowane lub zdestabilizowane tRNA poprzez aktywność egzonukleaz 5′-3′ Rat1 i Xrn1 (Alexandrov i in., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD jest wywoływany w mutantach pozbawionych którejkolwiek z kilku modyfikacji w ciele tRNA lub poprzez mutacje destabilizujące, a dla wszystkich zidentyfikowanych substratów RTD, delecja MET22 w pełni przywraca poziom tRNA i wzrost (Alexandrov i in., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Przypuszcza się, że tłumienie RTD w szczepach met22Δ jest spowodowane hamowaniem egzonukleaz Rat1 i Xrn1 przez metabolit 3′-fosfoadenozyno-5′-fosforan, którego poziom wzrasta, gdy Met22 jest zahamowany (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).Wiadomo, że
RTD działa na kilka specyficznych gatunków tRNA, które zostały zidentyfikowane i zbadane przy użyciu siedmiu podejść (Ryc. 1). Pierwsze podejście polegało na wykorzystaniu mikromacierzy do porównania poziomów tRNA w skali całego genomu u mutantów modyfikujących wrażliwych na temperaturę trm8Δ trm4Δ (brak m7G46 i m5C) oraz u szczepów pokrewnych w warunkach półpermisywnych. W ten sposób zidentyfikowaliśmy substrat RTD tRNAVal(AAC), ponieważ miał on obniżony poziom tRNA w mutancie trm8Δ trm4Δ w stosunku do WT lub odpowiadających mu pojedynczych mutantów (Alexandrov i in., 2006).
Rysunek 1. Różne podejścia zastosowane do identyfikacji i analizy substratów RTD.
W drugim podejściu, do zbadania zarówno szybkości, jak i specyficzności degradacji tRNA dla substratów RTD w mutantach modyfikujących wrażliwych na temperaturę, zastosowano northern blots. W tym podejściu, RNA wyizolowane z komórek w różnych punktach czasowych po zmianie temperatury było analizowane pod kątem poziomów specyficznych tRNA. Analiza ta wykazała, że 50% tRNAVal(AAC) było degradowane w mutancie trm8Δ trm4Δ w ciągu 30 min od zmiany temperatury z 28 do 37 °C, podczas gdy podobnie hipomodyfikowane tRNAiMet, tRNAMet i tRNAPhe nie wykazywały spadku (Alexandrov i in., 2006; Chernyakov, Whipple i in., 2008). Ponadto, względne poziomy naładowanego i nienaładowanego tRNA można było zmierzyć wykonując northern blot w warunkach kwaśnych, co wykazało, że poziomy naładowanego tRNAVal(AAC) zostały zredukowane o 50% w ciągu 25 min zmiany temperatury w mutancie trm8Δ trm4Δ, a poziomy nienaładowanego tRNAVal(AAC) okazały się nie zmienione (Alexandrov i in., 2006).
Trzecie podejście polegało na supresji tRNA o wysokiej kopii, gdzie plazmid o wysokiej kopii wyrażający określony tRNA został wprowadzony do wrażliwego na temperaturę mutanta modyfikującego tRNA. Jeśli tRNA był substratem RTD i wrażliwość na temperaturę była wynikiem degradacji pojedynczego gatunku tRNA, to nadekspresja tRNA stłumiłaby defekt. W ten sposób odkryliśmy, że wrażliwość na temperaturę mutanta trm8Δ trm4Δ była tłumiona przez plazmid o wysokiej kopii wyrażający tRNAVal(AAC), wskazując, że wrażliwość na temperaturę była głównie spowodowana utratą tRNAVal(AAC) i że brakujące modyfikacje były ważne dla stabilności tRNA (Alexandrov i in., 2006). Podobnie, substraty RTD kilku innych mutantów modyfikujących tRNA również zostały zidentyfikowane przy użyciu tego podejścia, w tym tRNASer(CGA) i tRNASer(UGA) w mutantach tan1Δ trm44Δ (brak ac4C12 i Um44) oraz w mutantach trm1Δ trm4Δ (brak m2,2G26 i m5C) (Chernyakov, Whipple i in., 2008; Dewe i in., 2012; Kotelawala i in., 2008).
Po czwarte, zastosowaliśmy podejście substytucji genetycznej w celu zidentyfikowania determinantów RTD w rodzinie tRNASer poprzez zastąpienie pojedynczego istotnego genu tRNASer(CGA) (SUP61) różnymi wariantami tRNASer(CGA) w szczepie WT i met22Δ, a następnie ocenę wzrostu w różnych temperaturach. Używając tego podejścia, ustaliliśmy, że połączone stabilność akceptora i T-stemów były silnymi determinantami podatności na RTD w rodzinie genów tRNASer(CGA) (Whipple i in., 2011). Wniosek ten został dodatkowo poparty przez piąte podejście do pomiaru RTD, w którym wykazaliśmy in vitro, że warianty tRNASer(CGA) pozbawione ac4C12 i Um44, lub z mutacjami destabilizującymi w rdzeniu akceptorowym, były bardziej podatne na trawienie przez Xrn1 i bardziej podatne na usuwanie 5′ fosforanu przez fosfatazę jelitową cielęcą (Whipple i in., 2011).
W tym przeglądzie omówimy nasze niedawno opracowane szóste i siódme podejście do badania substratów RTD, które okazały się niezwykle cenne w poszerzaniu naszego zrozumienia szlaku RTD. Szóste podejście wykorzystuje fluorescencyjny reporter do kompleksowej analizy bibliotek tysięcy wariantów tRNA w szczepach WT i met22Δ. Dzięki temu podejściu zidentyfikowaliśmy 643 prawdopodobnych kandydatów na substraty RTD, wiele z nich w regionach, w których nie spodziewano się wywoływać RTD na podstawie wcześniejszych prac (Guy i in., 2014). Pokażemy dane demonstrujące, że to podejście może być wykorzystane do badania funkcji tRNA w różnych warunkach i omówimy inne zastosowania tego podejścia.
Siódme podejście wykorzystuje przedłużenie primera trującego do pomiaru poziomów tRNA w szczepie WT i met22Δ i jest cenne w swojej zdolności do specyficznego pomiaru wariantu tRNA, nawet w obecności WT tRNA, którego sekwencja może różnić się tylko jedną resztą. Przedstawiamy szczegółową metodologię tego podejścia i omawiamy niektóre z jego innych możliwych zastosowań.