Tumor Xenograft

Characterization of Xenograft Banks

Praca z guzami PDX wymaga utworzenia i utrzymania banku guzów, które są wszczepiane myszom, a następnie seryjnie przenoszone z pokolenia na pokolenie, chyba że ten łańcuch zdarzeń zostanie przerwany przez zamrożenie próbek. Uważa się, że PDX odtwarzają cechy morfologiczne pierwotnego guza bardziej precyzyjnie niż ksenografty ustalonych linii komórkowych, pod względem profilowania histologicznego i genetycznego. Odtwarzają one heterogenność ludzkich nowotworów i mają większą wartość w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie.8-16

Zmiany zapalne są generalnie łatwe do zidentyfikowania metodami histologicznymi. W przeciwieństwie do guzów, określenie czy guz jest tym oczekiwanym, czy też ma inne pochodzenie, może być trudniejsze. Rzeczywiście, guzy u myszy mogą rozwijać się w miejscu ksenograftów. Większość takich guzów to chłoniaki (Rys. 4.2B),11 ale czasami obserwuje się mięsaki z komórek wrzecionowatych (Rys. 4.2C), a inne guzy u myszy, takie jak guzy gruczołu sutkowego w tkance podskórnej samic myszy, mogą być również obserwowane w rzadkich przypadkach. Spontaniczne guzy lub zmiany podobne do guzów mogą również rozwijać się w odległych narządach i mogą być błędnie interpretowane jako możliwe przerzuty (np. gruczolaki płuc; rys. 4.2D). Proste badanie morfologiczne tkanki zazwyczaj jasno wskazuje, czy guz jest tego samego typu, co oryginalny guz ludzki. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku większości ksenograftów raka, które mają morfologię bardzo różną od chłoniaków czy mięsaków. Raki są generalnie tworzone przez duże komórki, wyraźnie ułożone w sznurki, kanaliki lub zraziki z widoczną łącznotkankową tkanką śródmiąższową. Chłoniaki (zarówno ludzkie jak i zwierzęce) składają się z arkuszy małych okrągłych komórek o skąpej podścielisku, a mięsaki składają się ze strumieni rozszczepionych komórek. Dlatego też łatwo jest rozróżnić te różne typy guzów wzrokowo. Diagnoza może być trudniejsza, jeśli pierwotny guz jest „niebieskim guzem”, guzem składającym się z małych komórek z bardzo małą ilością cytoplazmy i hiperchromatycznym jądrem, pojawiającym się głęboko bazofilnym (niebieski kolor) pod mikroskopem w małym powiększeniu po barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E). Guzy blastyczne, takie jak retinoblastoma, są zazwyczaj guzami niebieskimi. W takich przypadkach, morfologia guza może być trudna do zinterpretowania, szczególnie, że najbardziej specyficzne cechy niektórych guzów, takie jak rozety wielu guzów blastycznych, są ogólnie brakujące lub słabo reprezentowane w ksenograftach. Guzy anaplastyczne, w których komórki nowotworowe mają małe lub żadne morfologiczne podobieństwo do normalnych komórek, mogą być również trudne do scharakteryzowania bez technik pomocniczych. Jak stwierdzono, podczas gdy stosunkowo łatwo jest odróżnić mięsaka od chłoniaka lub dobrze zróżnicowanego raka, odróżnienie ksenograftów mięsaka od zmian zapalnych lub mięsaków u myszy może być trudne, ponieważ zmiany te mogą mieć bardzo podobną morfologię.6

Gdy mamy do czynienia z trudnymi przypadkami, lub po prostu w celu potwierdzenia, że guz naprawdę jest pochodzenia ludzkiego przed rozpoczęciem eksperymentu, kilka różnych metod zaprojektowanych w celu ujawnienia specyficznych dla gatunku białek lub sekwencji nukleotydów, opartych na immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ, może być wykorzystanych do identyfikacji komórek ludzkich lub murine. Immunohistochemiczna charakterystyka białek charakterystycznych dla linii komórkowej jest przydatna do określenia tkanki pochodzenia guza.

Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwy rozwój ludzkich chłoniaków w miejscu wszczepienia guzów nielimfoidalnych, głównie podczas wstępnej implantacji.11 Takie guzy noszą specyficzne markery komórek ludzkich; może to prowadzić do pomylenia ich z prawdziwym ksenograftem, jeśli nie przeprowadzi się badania morfologicznego zmiany. W badaniach PDX, większość obserwowanych ludzkich chłoniaków wydaje się rozwijać z limfocytów obecnych w próbce tkanki użytej do wstępnego wszczepienia. Jeśli komórki te są zakażone wirusem Epsteina-Barr (EBV), limfocyty B mogą ulegać transformacji i przekształcać się w komórki nowotworowe.17,18 Komórki te są skutecznie eliminowane przez układ odpornościowy u ludzi immunokompetentnych, natomiast ich wszczepienie u myszy z obniżoną odpornością umożliwia rozwój złośliwych komórek B i zajęcie miejsca pierwotnego ludzkiego guza.11 Kilka przypadków EBV-ujemnych obwodowych ludzkich chłoniaków T-komórkowych również opisano w kontekście PDX.19 Jeśli pierwotny ludzki guz był wyraźnie inny niż chłoniak (np. gruczolakorak), wówczas rozwój ludzkiego chłoniaka jest łatwy do opanowania, ponieważ proste badanie morfologiczne wystarczy, aby wykazać, że guz rosnący w miejscu wszczepienia nie jest typu oczekiwanego i dlatego powinien zostać odrzucony. Jeśli pierwotny guz był „niebieskim guzem”, to wykazanie, że guz znaleziony w miejscu przeszczepu jest pochodzenia ludzkiego może prowadzić do błędnej interpretacji przy braku dalszej charakterystyki, ponieważ ten guz może być w rzeczywistości ludzkim chłoniakiem wynikającym ze złośliwej transformacji limfocytów zakażonych EBV obecnych w pierwotnym guzie, jak omówiono wcześniej.

Kiedy ksenograft jest ustalony (guzy PDX są ogólnie uważane za ustabilizowane po trzech do pięciu pasażach20), należy go scharakteryzować, zarówno pod względem typu histologicznego, jak i jego zróżnicowania. Typ histologiczny guza jest na ogół dobrze zachowany w ksenograftach, więc na przykład raki naskórkowe i gruczolakoraki cewkowe mają te same cechy, gdy tworzą PDX.21 Uważa się, że ta stabilność fenotypowa jest powiązana ze stabilnością biochemiczną, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby wyraźne zmiany biochemiczne skutkowały zachowaniem cech morfologicznych.6 Pierwszym pytaniem, na które musi odpowiedzieć patolog, jest zatem to, czy obecny guz odtwarza morfologiczne i biochemiczne cechy tkanek macierzystych.17 Jeśli tak nie jest, to może on odpowiadać guzowi mysiemu lub mogła nastąpić istotna zmiana we wzorze różnicowania guza, co wymagałoby dalszych badań.8

Jednakże w niektórych przeszczepach pierwszej generacji i coraz częściej po kolejnych pasażach, niektóre guzy mogą mieć tendencję do stawania się mniej zróżnicowanymi, z mniejszą liczbą przewodów lub acini w gruczolakorakach i większymi wskaźnikami mitozy, pleomorfizmu jądrowego i atypii.20

Szczególne szczegóły morfologiczne mogą się zmieniać podczas seryjnych pasaży, z nabyciem wydzielania mucyny lub różnicowania neuroendokrynnego, na przykład, z których oba są kryteriami progresji guza w niektórych rakach (np. rak prostaty).22 Podobnie, wzór różnicowania guza może być zmieniony przez modyfikacje warunków przeszczepienia, ze zmianami statusu hormonalnego gospodarza z powodu kastracji lub suplementacji hormonalnej, na przykład.22

Określenie, czy morfologia guza jest zachowana po przeszczepieniu, seryjnych pasażach lub eksperymentach, jest jedną z trudności, z którymi borykają się patolodzy. Rzeczywiście, niezależne ksenografty z tego samego guza nigdy nie są ściśle identyczne, ze względu na zmienność biologiczną i heterogenność wewnątrz guza. Nawet różne sekcje tego samego guza i różne regiony tej samej sekcji mogą wykazywać różnice morfologiczne. Morfologiczne cechy komórek i ich jąder, ich przestrzenne rozmieszczenie, indeks mitotyczny i obecność atypowych mitoz, liczba ciałek apoptotycznych i częstość występowania martwicy, obfitość zrębu i unaczynienia różnią się między sekcjami i między polami. Patolog musi zatem określić, czy globalny wzór guza jest zachowany i, co ważniejsze, czy histologia ksenoprzeszczepionego guza odpowiada histologii oryginalnego guza dawcy. Międzynarodowe klasyfikacje ludzkich guzów powinny być używane jako podstawa dokładnej klasyfikacji patologicznej ksenograftów, ale wymagany jest pewien stopień elastyczności, ponieważ ksenografty nigdy nie odtwarzają idealnie morfologii oryginalnego ludzkiego guza.

Gdy ksenografty są śledzone w kolejnych pasażach lub podczas eksperymentów, zmiany jakościowe, takie jak przejście z trabekularnego do rurkowego wzoru, jeśli są powtarzalne, mogą być uważane za znaczące, podczas gdy zmiany ilościowe, takie jak zmiany indeksu mitotycznego lub ilości martwicy, szczególnie jeśli są subtelne, powinny być interpretowane z dużą ostrożnością.

Kolejna trudność w analizach histologicznych ksenobanków nowotworów wynika z częściowo subiektywnej natury analizy morfologicznej. Jeśli obserwatorzy dobrze znają morfologię określonego typu guza, to ich percepcja jest precyzyjnie dostrojona do wykrywania drobnych szczegółów, które z czasem mogą stać się bardziej widoczne. Wskazane jest wybranie próbki ustabilizowanego PDX, która będzie używana jako odniesienie, do porównania z nowymi próbkami, aby zapewnić, że slajdy są odczytywane tak obiektywnie, jak to tylko możliwe. Cyfrowy bank slajdów wirtualnych może znacznie ułatwić to zadanie. Jeśli nie można wykryć żadnej oczywistej różnicy między szkiełkiem testowym a referencyjnym, wówczas zmianę można uznać za „podobną”; nie oznacza to, że są one identyczne, a jedynie, że nie można wykryć żadnych znaczących zmian morfologicznych.

Dla pierwszej próbki obserwowanej w eksperymencie ksenograftowym, odniesieniem powinna być próbka oryginalnego ludzkiego guza, lub przynajmniej mieć morfologiczny opis jako dany guz w raporcie patologicznym pacjenta. Jeżeli takie odniesienie nie jest dostępne, patolog może po prostu powiedzieć, że guz jest „morfologicznie zgodny” z ksenograftem ludzkiego guza danej kategorii.

.