[4] Comparação da proteína fluorescente verde melhorada e sua forma desestabilizada como repórteres de transcrição

Este capítulo descreve a utilidade da proteína fluorescente verde (GFP) como um gene repórter no estudo da expressão gênica. A GFP emite luz fluorescente na excitação, sem a adição de substrato ou co-factor, tanto in vivo como in vitro. A atividade de fluorescência GFP pode ser detectada usando um microscópio de fluorescência, um fluorômetro, uma máquina de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), ou um leitor de microplacas de imagem. A GFP aprimorada (EGFP) é uma GFP mutante com fluorescência mais brilhante que torna a detecção muito mais sensível. O uso da GFP como um gene repórter oferece uma série de vantagens. Estas incluem a análise em tempo real, a entrega mínima de amostras, a possibilidade de análise de grande quantidade e a alta sensibilidade. No entanto, a GFP é uma proteína estável, de modo que é facilmente acumulada quando expressa em células. A acumulação torna a expressão induzível do repórter insensível a qualquer mudança na indução e, portanto, seria difícil de usar em estudos cinéticos. Este capítulo discute a utilidade do EGFP e do EGFP desestabilizado (dEGFP) como repórteres de transcrição, fundindo-os com a sequência de ligação NF-KB e o promotor da timicline kinase (TK), e comparando a diferença de expressão entre EGFP e dEGFP. Discute que ambos EGFP e dEGFP podem ser usados como repórteres em estudos de transcrição. Além disso, o dEGFP é mais sensível em resposta às mudanças no tratamento do fator de necrose tumoral (TNF) devido à sua taxa de rotação mais rápida.

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