A proteína de baixa densidade relacionada ao receptor de lipoproteínas (LRP), um membro da família do gene receptor de lipoproteínas de baixa densidade, medeia a absorção celular de uma diversidade de ligandos. Uma acompanhante dobrável, a proteína associada ao receptor 39-kDa (RAP) que reside nos compartimentos iniciais da via secretora inibe a ligação de todos os ligandos ao receptor e pode servir para prevenir a ligação prematura dos ligandos ao receptor durante o tráfico para a superfície celular. Para elucidar as interações moleculares subjacentes à interação entre o receptor, a RAP e os ligandos, analisamos e delineamos os sítios de ligação do ativador do plasminogênio inibidor-1 (PAI-1), ativador do plasminogênio tipo tecido (t-PA).complexos PAI-1, RAP e o fragmento anti-LRP Fab Fab A8. Para isso, geramos uma série de fragmentos recombinantes solúveis, abrangendo o segundo grupo de repetições tipo complemento (C3-C10) e a repetição do fator de crescimento epidérmico de flanco amino-terminal (E4) do LRP (E4-C10; aminoácidos 787-1165). Todos os fragmentos foram expressos por células renais de hamster bebé transfectadas de forma estável e purificadas por cromatografia de afinidade. Um estudo detalhado da ligação dos ligandos aos fragmentos usando ressonância plasmônica superficial revelou a presença de três sítios distintos, dependentes de Ca2+ ligandos no domínio cluster II (Cl-II) do LRP. t-PA.PAI-1 complexes, bem como PAI-1 bind a um domínio localizado na porção amino-terminal do Cl-II, abrangendo as repetições E4-C3-C7. Adjacente a este sítio e parcialmente sobreposto é um sítio de ligação RAP de alta afinidade, localizado nas repetidas C5-C7. Fab A8, um pseudo-ligante do receptor, liga-se a um terceiro local de ligação dependente de Ca2+ nas repetidas C8-C10 na extremidade carboxil-terminal de Cl-II. Em seguida, estudamos a inibição mediada por RAP da ligação ligante ao LRP e à Cl-II. Como esperado, observamos uma forte inibição do complexo t-PA.PAI-1 e da ligação Fab A8 ao LRP pelo RAP (IC50 congruente com 0,3 nM), enquanto no experimento reverso, competição do t-PA. Os complexos PAI-1 e Fab A8 para ligação do RAP ao LRP só puderam ser mostrados em altas concentrações de concorrentes (>/=1 microM). Curiosamente, mesmo que as constantes de dissociação de equilíbrio para a ligação do RAP ao LRP e ao Cl-II sejam semelhantes, a ligação dos ligandos ao Cl-II só é impedida pelo RAP em concentrações que sejam pelo menos 2 ordens de magnitude maiores do que as necessárias para inibição da ligação dos ligandos ao LRP. Nossos resultados favorecem modelos que propõem a inibição alostática induzida por PAD da ligação dos ligandos ao PRBL que podem requerer moieties de PRL que estão localizadas fora do Cl-II do receptor.