AI-1 taxa de crescimento celular controlada por sinal
Primeiro teste de controle da taxa de crescimento celular da E. coli através da regulação transcripcional do ptsH, um gene envolvido no transporte de açúcar. HPr (codificado por ptsH) é amplamente reconhecido como uma de uma série de proteínas (por exemplo, E1, HPr, EII) que transfere sequencialmente um grupo fosforil de fosfenoolpiruvato (PEP) para glicose (ou outros carboidratos PTS)34. HPr é altamente conservado37. Recentemente descobrimos que o HPr interage com a AI-2 kinase LsrK, influenciando a absorção de AI-235. Aproveitamos a funcionalidade de modulação do AI-2 mais tarde quando construímos a célula sensora do AI-2. Aqui, nós demonstramos que as cepas mutantes ptsH crescem mais lentamente do que as cepas do tipo selvagem em meios mínimos contendo glicose (Fig. 1a Suplementar). Quando a ptsH foi colocada sob um promotor induzível IPTG em um mutante ptsH, a taxa de crescimento pôde ser controlada com base na adição de IPTG (Suplemento Fig. 1b). Importante, nós demonstramos que a expressão indutiva de ptsH resulta em um aumento na taxa de crescimento celular. Igualmente importante, este comportamento é independentemente de a mídia conter ou não glicose como a principal fonte de carbono (Suplemento Fig. 1c).
Baseado nesta prova de conceito, nós desenvolvemos em seguida o sinal QS taxa de crescimento controlada. Para construir a deformação do controlador, o ptsH foi colocado sob controle do promotor AI-1 lasI QS no plasmídeo pAHL-HPr (Fig. 2a) em uma deformação mutante ptsH PH04. Em outros pontos do plasmídeo, tanto o dsRedExpress2, para visualização celular, como o LasR, necessário para a ativação do promotor lasI, foram expressos sob um promotor T5 constitutivo. A adição de AI-1 à deformação do controlador aumentou a taxa de crescimento celular até 1,8 vezes a taxa de crescimento basal de uma forma dependente da dose (Fig. 2b). A taxa de crescimento específica medida (entre 1 e 4 h após a adição de AI-1) serviu como base para um modelo de taxa de crescimento do tipo Monod baseado no nível de AI-1 (Fig. 2c).
AI-1 taxa de crescimento controlado por sinal de quorum sensing através da expressão de HPr. a Schematic of AI-1 growth responsive controller cells (PH04 pAHL-HPr). O AI-1 liga o LasR (expresso constitutivamente) e ativa o laser promotor resultando na expressão de HPr que aumenta a taxa de crescimento celular. b Curvas de crescimento de culturas PH04 pAHL-HPr cultivadas com níveis variáveis de AI-1. As culturas foram cultivadas com DO 0,15 (t = 0) e o AI-1 foi suplementado com 40 min (indicado pela seta). A tabela mostra a taxa média de crescimento de 1 a 4 h após a adição de AI-1. c A taxa de crescimento relativa à taxa de crescimento basal (0,28 ou 0,32 h-1) para diferentes concentrações de AI-1 é plotada para duas experiências separadas (pontos amarelos e laranja). A função fHPr descrevendo a taxa de crescimento relativo como uma função do AI-1 é plotada (linha azul). A = 1, B = 1, C = 29, D = 2,1, E = 0,48. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem
AI-1 modula a composição da co-cultura de células do controlador
As células do controlador regulado AI-1 foram então co-cultivadas com outras linhagens para verificar que a adição do AI-1 alterou a composição da co-cultura. As células controladoras de crescimento expressando uma proteína vermelha fluorescente (PH04 pAHL-ptsH) foram co-culturadas com PH04 pCT6 ou TOP10 pT5G7. A PH04 pCT6 tem uma taxa de crescimento basal semelhante à PH04 pAHL-ptsH, enquanto a TOP10 pT5G cresce significativamente mais rápido. As culturas foram inoculadas com densidades celulares aproximadamente iguais e suplementadas com níveis variados de AI-1. Após 8 h, as amostras foram coletadas para análise usando microscopia de fluorescência e quantificadas usando ImageJ. Como esperado, quando as células controladoras foram cultivadas com PH04, a composição da cultura das células controladoras aumentou com o aumento da concentração de AI-1 (Fig. 3a). Uma tendência similar foi observada quando as células foram cultivadas com TOP10, apesar da taxa de crescimento mais rápido do TOP10 (Fig. 3b). Ou seja, em co-culturas sem AI-1, a fração das células controladoras nas co-culturas com o TOP10 na verdade caiu significativamente dos ~0.5 para ~0.09 durante as 8 h seguintes. A adição de AI-1 contrariou essa diferença de taxa de crescimento e resultou em um nível mais alto de células controladoras durante o mesmo período de 8 h. Estes resultados demonstram que independentemente de outras linhagens na cultura e suas respectivas taxas de crescimento, o AI-1 (que não é uma molécula de sinalização de E. coli QS) modula a taxa de crescimento da linhagem do controlador e a mudança ocorreu suficientemente rápido de forma a permitir uma mudança observável na composição da cultura – de forma notável mesmo sob condições de lotes relativamente curtos (ao contrário de lotes alimentados, lotes repetidos, ou culturas contínuas).
AI-1 regula a taxa de crescimento celular em co-culturas. um PH04 pAHL-HPr (abreviado como HPr) co-culturado com PH04 pCT6 (abreviado como PH04). Cada cultura foi inoculada 0,5% para uma fração inicial de HPr de ~0,5. O nível de AI-1 indicado foi adicionado durante a inoculação. As amostras foram coletadas para análise da composição da co-cultura após 8 h. As barras de erro representam s.d. de quadruplicados técnicos. b PH04 pAHL-HPr (abreviado como HPr) co-cultura com TOP10 pT5G (abreviado como TOP10). Cada cultura foi inoculada 0,5% para uma fração inicial de HPr de ~0,5. O nível de AI-1 indicado foi adicionado durante a inoculação. As amostras foram coletadas para análise da composição da co-cultura após 8 h. As barras de erro representam s.d. de triplicatas técnicas. c PH04 pAHL-HPr (abreviado como HPr) co-cultura com PH04 pSox-LasI com ou sem indução de 1 µM PYO. A fração inicial HPr em co-cultura foi de ~0,5. Amostras coletadas para medição de AI-1 após 2 h e 4 h e análise da composição da co-cultura após 5 h. As barras de erro representam s.d. de duplicatas biológicas. Os dados da fonte são fornecidos como um arquivo de dados da fonte
Próximo, a estirpe do controlador regulado AI-1 foi co-cultada com células que produzem AI-1 quando induzida. PH04 pSox-LasI e PH04 pAHL-HPr foram co-culturizados juntos. Plasmid pSox-LasI contém lasI, que sintetiza o AI-1, sob o promotor de piocianina induzível soxS7. Nesta experiência, a estirpe controladora recebe um sinal de uma estirpe tradutora que, por sua vez, produziu AI-1 em resposta à piocianina. Desta forma, o esquema de controle da co-cultura é mostrado para responder a um sinal molecular particular. Aqui, cada cultura foi inoculada com densidades iniciais aproximadamente iguais e as co-culturas foram expostas ou não à piocyanina. As culturas expostas mostraram aumento da produção de AI-1 e correspondente aumento da composição de PH04 pAHL-HPr em 5 h (Fig. 3c). Estes resultados demonstram que o AI-1 produzido a partir de uma estirpe alternativa pode modular a taxa de crescimento da estirpe do controlador, e que isto pode ocorrer em escalas de tempo necessárias para afetar a mudança em um processo de lote. Além disso, isto demonstra a viabilidade potencial de uma co-cultura regulada pelo usuário com base na aplicação específica de uma molécula ou indutor, neste caso a piocyanina. Em seguida, nós projetamos a estirpe do tradutor para criar uma co-cultura regulada autonomamente baseada na molécula sinalizadora de AI-2 penetrante.
Concepção de células do tradutor com detecção de AI-2
Para construir linhas de células que detectam AI-2 e produzem AI-1, nós projetamos estirpes para ativar a expressão do LasI, que sintetiza AI-1, quando o promotor AI-2 lsr é ativado. Nós usamos um sistema de dois plasmídeos para amplificar a expressão do fraco promotor lsr25 (Fig. 4a). Resumidamente, a AI-2 é fosforilada por LsrK e a AI-2 fosforilada alivia a repressão do promotor por LsrR, aumentando a transcrição dos genes do transportador lsr e acelerando a absorção da AI-2. Ao mesmo tempo, a ativação mediada por AI-2 do promotor lsr resulta na transcrição da RNA polimerase T7 do plasmídeo pCT6 e subsequente transcrição da lasI do plasmídeo pET-LasI.
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Células tradutoras engenhadas produzem AI-1 em resposta ao AI-2. O AI-2 fosforilado ativa a expressão da RNA polimerase T7 e subsequente expressão da LasI que sintetiza o AI-1. b AI-1 produzido por CT104 pCT6 pLasI ou PH04 pCT6 pLasI cultivado em diferentes meios com e sem adição de AI-2. AI-2 foi adicionado como indicado em ~OD 0.1 e as amostras para medição de AI-1 foram colhidas 6 h mais tarde. As barras de erro representam s.d. entre duplicatas técnicas. Os dados da fonte são fornecidos como um arquivo de dados da fonte
O sistema foi construído pela primeira vez na estirpe do hospedeiro E. coli CT104, que é um mutante luxS (por exemplo, incapaz de produzir AI-2). O CT104 também não possui lsrFG, responsável pela degradação do sinal fosforilado AI-2, aumentando a sensibilidade da célula ao AI-238. Verificamos esta linha celular, CT104 pCT6 pET-LasI, produziu AI-1 quando cultivada em meios condicionados (CM) a partir da AI-2 produzindo BL21 (Fig. 2 Suplementar). BL21 foram cultivados em densidades celulares variáveis, CM foi coletado, e células CT104 foram cultivadas no CM coletado. Importante, a AI-1 produzida pelas células CT104 correlacionou-se com a densidade das células BL21 produtoras de AI-2 (Suplemento Fig. 2a). Também testamos se células tradutoras adicionadas aos consórcios com frações variáveis de células produtoras de AI-2 poderiam produzir o sinal de AI-1 com base na composição dos consórcios. Células CT104 foram adicionadas a culturas de proporções variáveis de BL21 (luxS+) a BL21 ΔluxS. Após 6 h, o nível do sinal de AI-1 nos meios extracelulares foi indicativo da composição da cultura, que, por sua vez, é baseada principalmente na fração inicial das células luxS+25 (Suplemento Fig. 2b).
Os experimentos acima demonstraram que uma linha de células poderia ser construída para produzir AI-1 em resposta à AI-2 a partir de células produtoras de AI-2. Estes experimentos foram realizados em meios LB e não em meios com glicose. A presença de glicose inibe a captação de AI-2 e a atividade promotora de lsr39 e o uso de células CT104 poderia ser potencialmente limitado a meios sem glicose (veja a Figura Suplementar 3 para esquema do caminho do AI-2 QS). Com base no conhecimento do sistema de QS AI-2, tentamos criar uma estirpe que fosse capaz de absorver a AI-2 e activar o promotor lsr em meios contendo glucose. Desta forma, os nossos resultados poderiam ser aplicados de forma mais geral. Anteriormente, demonstramos que o HPr (codificado por ptsH) interage com LsrK, inibindo a atividade da cinase LsrK, e que os mutantes ptsH demonstraram a absorção de AI-2 mesmo em meios contendo glicose35. Assim, nós formulamos hipóteses, o uso do PH04 (ΔptsH ΔluxS) como uma cepa hospedeira permitiria a produção de AI-2 baseada em AI-1 em meios contendo glicose. Testamos as células do tradutor usando ambas as cepas hospedeiras em meio LB e M9 com e sem AI-2. O nível de AI-1 produzido dependia da adição de AI-2, mas também da estirpe hospedeira e do meio (Fig. 4b). Ambas as cepas produziram AI-1 quando as células foram adicionadas aos meios LB com AI-2. Como esperado, em meios M9, o uso da estirpe hospedeira CT104 resultou em uma pequena ou insignificante mudança de prega na atividade da AI-1 ao comparar culturas com e sem a AI-2. É importante notar que as células do tradutor PH04, entretanto, mostraram produção ativada por AI-2 de AI-1 em meio M9 + glicose. Desta forma, o sistema projetado poderia ser usado em meios contendo glucose.
Caracterização das células tradutoras PH04
Células tradutoras PH04 captam a molécula do sinal AI-2, transduzem o sinal ativando a expressão do LasI e sintetizam e secretam o AI-1. A saída desejada do AI-1 é então uma função da entrada do AI-2. Caracterizamos a produção de AI-2 sinalizada de AI-1 na estirpe do tradutor PH04 ao longo do tempo e para uma gama de concentrações de AI-2 biologicamente relevantes. A taxa de produção de AI-1 pelas células do tradutor PH04 foi encontrada como sendo a dose dependente da AI-2 (Fig. 5a). Observamos que sob estas e condições similares, a AI-2 é consumida principalmente dentro de 4 h (Fig. 5b). A adição de AI-2 ou produção baseada em AI-2 de AI-1 nessas culturas de lote resultou em nenhuma diminuição observável no crescimento celular (Fig. 5c). Nós então caracterizamos a taxa de produção de AI-1 por célula ao longo do tempo para cada concentração de AI-2 testada, traçando uma função logística através dos dados de AI-1, determinando a derivada desta equação ao longo do tempo, e dividindo a derivada pela densidade celular ao longo do tempo (Tabela Suplementar 1) produzindo uma taxa de produção específica dependente do tempo. Os gráficos resultantes (Fig. 5d) mostram a taxa estimada por célula da produção de AI-1 em função da adição de AI-2 e do tempo da adição de AI-2. Como será mostrado mais tarde, isto se alinha com uma observação subjacente, observamos que a trajetória da expressão gênica em resposta a um sinal inicial é bastante robusta21,38,40.
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Caracterização da produção de AI-1 em células tradutoras. Células tradutoras PH04 cultivadas em meio de glucose M9 com concentrações variáveis de AI-2. As células foram inoculadas a partir de culturas noturnas e o AI-2 foi adicionado como indicado em t = 0. a níveis extracelulares de AI-1 ao longo do tempo. As barras de erro representam s.d. de duplicatas técnicas. b Atividade extracelular do AI-2 ao longo do tempo. As barras de erro representam s.d. de duplicatas técnicas. c Densidade celular ao longo do tempo. d Funções para a taxa de produção do AI-1, fAI1, para diferentes concentrações de AI-2 (linhas sólidas) e taxas de produção do AI-1 calculadas com dados experimentais (pontos). Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem
Nexterior, o efeito do AI-1 produzido pelas células do tradutor PH04 sobre a taxa de crescimento das células do controlador responsivo do AI-1 foi testado. Ou seja, células responsivas ao crescimento foram adicionadas à CM contendo AI-1 de células tradutoras que tinham sido expostas a níveis variáveis de AI-2 e cultivadas durante ~3 h (Suplemento Fig. 4a). Além do que foi mostrado na Fig. 5 onde a AI-1 é gerada a partir da exposição direta à AI-2, este experimento demonstra que a tradução celular da AI-2 para a AI-1 pode ser feita com a expressão necessária e dinâmica de cultura celular de modo a influenciar a taxa de crescimento da segunda população (Suplemento Fig. 4b). Observamos também, que a taxa de crescimento dinâmico das células controladoras diminuiu no tempo durante as 3 h seguintes. Esta observação foi tornada mais dramática em experimentos posteriores de co-cultura.
Regulação autônoma da composição da co-cultura
A seguir adicionamos as células tradutoras (chamadas de População A) e as células controladoras responsivas ao AI-1 (População B) a soluções com uma gama de concentrações iniciais de AI-2. Em co-culturas de células tradutoras e células controladoras, as células tradutoras regulam autonomamente a composição dos consórcios com base no nível AI-2 inicial. Na Figura Complementar 5, as co-culturas com níveis iniciais aumentados de AI-2 resultaram num aumento de AI-1 (Figura Complementar 5b) e num aumento correspondente na abundância relativa da População B (Figura Complementar 5a). Estes resultados demonstraram o conceito de controle autônomo mediado pelo sinal da população dos consórcios. Importante, estimativas da taxa de crescimento para a População A e População B concordaram com os valores da taxa de crescimento esperada medidos durante experimentos de monocultura (Suplemento Fig. 5c).
Então, tendo demonstrado que células tradutoras poderiam regular a composição dos consórcios com base na exposição à AI-2, desenvolvemos um modelo matemático para caracterizar a dinâmica do sistema. Desta forma, pode-se prever o comportamento da co-cultura dadas as condições iniciais específicas, desenhos de taxa de crescimento, etc., a fim de determinar os parâmetros necessários para se obter um resultado desejado. Este modelo matemático conceitualmente simples foi criado para prever o comportamento da co-cultura usando dados das linhagens individuais. O modelo consiste em quatro equações diferenciais comuns, uma para cada densidade populacional, concentração do substrato e concentração de AI-1 (Tabelas Suplementares 2 e 3). Cinética de crescimento monodo com um coeficiente de rendimento constante foram usadas para modelar o crescimento celular e a concentração do substrato, com funções adicionais que contabilizam a produção e/ou efeitos das moléculas de QS. A AI-1 produzida pela População A é baseada tanto no nível de exposição da AI-2 como no tempo (fAI1). No trabalho anterior38, descobrimos que as trajetórias dependentes do tempo do comportamento celular eram uma consequência da exposição inicial ao autoindutor, de modo que as funções dependentes do tempo da produção de AI-1 seriam plausíveis aqui. A taxa de crescimento da população B foi formulada com base no nível prevalecente de AI-1 (fHPr). As taxas máximas de crescimento específico foram medidas usando dados experimentais, os rendimentos foram estimados com base na densidade de fase estacionária observada experimentalmente e nas concentrações iniciais conhecidas do substrato, e os valores de K1 e K2 foram escolhidos com base nos valores da literatura para glicose. O solver MATLAB (Versão R2016a) ode45 foi utilizado para resolver o sistema de EDOs. O modelo pode ser usado para mostrar como uma população de co-cultura está prevista a mudar com o tempo, dadas estas simples equações de taxa fenomenológicas e constantes de melhor ajuste. Como observado, isto fornece a base para determinar se uma co-cultura pode mesmo ser prevista a evoluir ao longo dos tempos limitados disponíveis em uma cultura em lote. Importante, nossos resultados de monoculturas são usados para simular resultados experimentais de co-culturas.
Isto é, nós avaliamos em seguida o controle de co-cultura programada autonomamente através de previsões de modelos. As co-culturas das populações A e B foram colocadas juntas para uma gama de populações celulares iniciais e foram então adicionadas à mídia com níveis prescritos de AI-2, a fim de colocar em movimento uma trajetória populacional. Em nosso sistema, a composição inicial é selecionada com base na proporção de células fornecidas na co-cultura e então a composição da cultura é ajustada autonomamente ao longo do tempo com base no nível de AI-2 nos meios de comunicação. Nós comparamos os resultados com o nosso modelo. Na Fig. 6, a composição da co-cultura e o nível de AI-1 após 5 h é mostrado para uma variedade de condições, incluindo variadas proporções iniciais de A:B e nível de AI-2. Nestes testes, usamos uma densidade populacional inicial de células. É importante notar que nosso modelo previu bem os resultados experimentais tanto do nível de AI-1 quanto da composição da co-cultura. Notamos também que o modelo pode ser usado para selecionar as condições iniciais que dão um resultado desejado. Por exemplo, para visar uma população B com densidade celular relativa de 55% a 5 h, a co-cultura poderia ser iniciada com uma relação inicial A:B de 60:40 e concentração de AI-2 de 40 µM. Outros cenários foram testados e validados, como descrito. Estes resultados demonstram claramente que a condição inicial da composição celular (por exemplo, razão A:B) e a exposição a diferentes níveis de AI-2 influenciam a trajetória da população da co-cultura. Igualmente importante, entretanto, é que a molécula de sinal ortogonal, AI-1, se comportou como modelada. Prevemos que, por extensão, a inclusão deste e de outros sinais tradutores permitirá que consórcios mais variados ou mais complicados sejam desenhados e/ou controlados.
Previsão do comportamento da co-cultura usando modelo matemático. Co-culturas de A e B foram adicionadas a meios contendo concentrações variadas de AI-2 e amostras para medição de AI-1 (esquerda) e da composição da co-cultura (direita) foram coletadas após 5 h. Ambas as linhas celulares foram inoculadas de culturas noturnas para uma DO inicial combinada de 0,05. A razão inicial de A:B é indicada. O controlo “C” usou PH04 pAHL-sfGFP em vez de PH04 pAHL-HPr como População B e usou meios com 0 µM AI-2. São apresentados tanto os resultados do modelo como os resultados experimentais. As barras de erro representam s.d. entre duplicatas técnicas (medições AI-1) e quadruplicatas técnicas (medições de composição). Os dados da fonte são fornecidos como um arquivo de dados da fonte
Ou seja, testamos o sistema controlador de co-cultura por exposição a uma concentração de AI-2, 80 µM, que foi maior que as concentrações de AI-2 usadas para caracterizar as células do tradutor, e para as quais não tínhamos modelo. Usamos os resultados da co-cultura (Fig. 6) para estimar o comportamento das células tradutoras em uma monocultura com essa concentração de AI-2. Em seguida, realizamos experimentos de monocultura adicionando 80 µM de AI-2 às células tradutoras e mostramos que fomos capazes de prever o comportamento da monocultura usando os dados da co-cultura e o modelo. A Figura 6a suplementar mostra a taxa de produção de AI-1 prevista a partir dos dados e modelo de co-cultura (linha) e a taxa real de produção de AI-1 durante o experimento de monocultura (pontos de dados). A Figura 6b suplementar mostra os níveis previstos de AI-1 na monocultura ao longo do tempo comparados com os níveis reais de AI-1 medidos. O nível de AI-1 previsto foi determinado usando o modelo, entrando na taxa de produção estimada de AI-1 e a densidade celular inicial da monocultura.
Por último, testamos nosso sistema de co-cultura durante um período de tempo mais longo usando alimentação repetida por lotes com múltiplas adições de AI-2 (Fig. 7). Aqui, nosso objetivo foi estender a trajetória da população além da obtida variando a composição inicial e exposição a um nível fixo de AI-2 em uma cultura simples por lotes. Desta forma, testamos a robustez do esquema de controle. Por exemplo, na Fig. 6, para culturas inicialmente com ~40% da população B, descobrimos que só conseguimos alcançar níveis da população B que se aproximavam de 60% e apenas pela exposição a níveis altos (>80 μM) de AI-2. Testando um sistema de lote repetido, pensamos que poderíamos elevar a população B a mais de 80% simplesmente ressuspendendo e ampliando o sistema a tempo. Adicionamos nossa co-cultura a meios com níveis variados de AI-2 e a cada 3 h ressuspendemos as células em meios frescos com AI-2 adicional. Imediatamente antes de cada ressuspensão, foram coletadas amostras para análise da concentração de AI-1 e composição da cultura celular (Fig. 7a, b). A densidade celular e a atividade AI-2 também foram medidas (Suplemento Fig. 7). Descobrimos que nesta configuração experimental mais complexa, o sistema geralmente funcionou como projetado. Descobrimos que pela exposição a menores quantidades de AI-2 (20 e 40 μM), pudemos alcançar quase 80% da população B. Durante este teste, entretanto, descobrimos que nossos resultados experimentais divergiram dos resultados previstos pelo nosso modelo matemático. Olhamos mais de perto a IA-1 produzida e a taxa de crescimento das culturas durante cada segmento de 3 h a fim de obter uma compreensão da dinâmica da cultura baseada na divergência observada com o modelo simples. Por exemplo, a AI-1 produzida durante o segundo e terceiro ciclos de 3 h foi maior do que o previsto pelo modelo. Em retrospectiva, isto fez sentido porque as células, após o primeiro ciclo de lote, já tinham produzido LasI (que sintetiza a AI-1), e a AI-2 adicional estava provavelmente induzindo a produção adicional de LasI (não incluímos uma etiqueta de degradação na LasI, então sua manutenção deveria ter sido antecipada). Ajustamos então o modelo para que a taxa de produção de AI-1 no início de cada ressuspensão subsequente em novos meios fosse a mesma do final do ciclo anterior (Fig. 7c, linhas sólidas). A incorporação dessas novas funções para a produção do AI-1 no modelo resultou em valores para o AI-1 que se encaixam perfeitamente nos dados experimentais do AI-1 (Fig. 7a, modelo em linhas sólidas). Similarmente, nós estimamos a taxa de crescimento das células controladoras (veja Nota Complementar 1) e descobrimos que a taxa de crescimento em combinação com as concentrações de AI-1 não se encaixava na nossa função fAI1 anterior (Fig. 7d). Notamos que para calcular a taxa de crescimento das células controladoras assumimos que a taxa de crescimento das células do tradutor permaneceu constante, embora elas possam ter diminuído ligeiramente como resultado de repetidas adições de AI-2. Enquanto a taxa de crescimento do controlador parecia inicialmente aumentar em função da IA-1, com ressuspensões subsequentes em meios frescos, a taxa de crescimento global diminuiu. Tínhamos notado anteriormente uma diminuição dinâmica na taxa de crescimento com a superexpressão de HPr e LasI (Figuras Suplementares. 4 e 5). Aqui, suspeitamos que ou uma carga metabólica colocada sobre as células por exposição repetida a níveis elevados de AI-1 ou redução do substrato ou dos níveis de nutrientes poderia ter sido a causa da diminuição do crescimento durante os ciclos posteriores. Importante, ao ajustar nosso modelo para que o efeito do AI-1 na taxa de crescimento diminuísse com o tempo (ver Nota Complementar 2), fomos capazes de ajustar nossos dados experimentais (Fig. 7b, modelo ajustado em linhas sólidas) sem adicionar complexidade ao modelo.
Sistema de cultura em lote repetido. Co-culturas de A e B foram inoculadas para uma DO inicial total de ~0,05 em meios com o nível indicado de AI-2. A cada 3 h, as culturas foram fiadas e ressuspendidas em meios frescos com AI-2. Antes da ressuspensão foram coletadas amostras para análise do nível de AI-1 e da composição da co-cultura. um nível de AI-1 nas culturas na inoculação (t = 0) e no final de cada segmento de 3 h. Os pontos de dados mostram dados experimentais e as linhas representam o modelo ajustado. As barras de erro representam s.d. entre duplicados biológicos. b Fração da população B na inoculação (t = 0) e no final de cada segmento de 3 h. Os pontos de dados mostram os dados experimentais. As linhas sólidas representam a Fração da População B prevista pelo modelo ajustado. As linhas tracejadas representam a diferença na taxa de crescimento entre as populações A e B previstas pelo modelo ajustado. As barras de erro representam s.d. entre duplicatas biológicas. c Taxa de produção de AI-1 ao longo do tempo para cada nível de AI-2 (fAI) usado no modelo original (linhas tracejadas) e no modelo ajustado (linhas sólidas). d Os pontos de dados são a taxa de crescimento média no tempo (População B) versus a concentração de AI-1 média no tempo para cada segmento de 3 h e cada concentração de AI-2. Veja a Nota Complementar 1 para detalhes sobre a estimativa da taxa de crescimento e do AI-1. A linha tracejada mostra a função fHPr original. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem
Em suma, nosso sistema de co-cultura respondeu como projetado se foi colocado em mídia sem AI-2 ou com um alto nível de AI-2. Além disso, nossos resultados mostraram densidades de população controláveis que abrangeram de 40 a 80% das células controladoras. Além disso, a comparação com nosso modelo original deu uma visão de como o sistema se comportava nessa configuração experimental mais complexa; as células tradutoras pareciam produzir níveis mais altos de AI-1 ao longo do tempo, enquanto as células controladoras pareciam ter reduzido as mudanças reguladas pelo AI-1 na taxa de crescimento ao longo do tempo.
Finalmente, o modelo poderia fornecer uma base para explorar em silico como as estratégias usadas aqui para culturas reguladas de forma autônoma (marcadas pela taxa de crescimento regulada pelo sinal e pela sinalização celular nativa) poderiam ser estendidas para outros sistemas, incluindo sistemas regulados pelo usuário ou programáveis que poderiam ser controlados dinamicamente. Por exemplo, as culturas de quimióstatos distinguem-se do sistema autónomo actual na medida em que as suas saídas são dirigidas por entradas especificadas pelo utilizador, tais como a taxa de diluição. Como primeira passagem, realizamos simulações de culturas de co-culturas de quimióstatos através da adição dos termos de fluxo padrão ao modelo de lote (Fig. 8, Tabelas Suplementares 4 e 5). Verificamos em alguns casos, que a taxa de diluição define uma composição de cultura em estado estacionário que, por sua vez, pode posteriormente ser “sintonizada” dentro de um intervalo limitado pela taxa de diluição. A “sintonização” pode ser obtida através da modulação externa da sinalização celular, por exemplo, pela adição exógena de moléculas de sinal. Estes casos ilustram como a interacção entre o nosso sistema autónomo e outros sistemas controlados pelo utilizador pode levar a trajectórias populacionais mais complexas. Os nossos resultados de simulação aqui servem como uma estrutura conceptual para controlar a composição dos consórcios em sistemas mais complexos e guiados pelo utilizador. Mais discussões sobre as simulações do quimiostato estão na Nota Complementar 3.