Detecção laboratorial e identificação de espécies Aspergillus por observação microscópica e cultura: a abordagem tradicional

Reconhecimento das características morfológicas

Os aspergilli são omnipresentes na natureza, podendo contaminar comumente espécimes e meios de cultura. Consequentemente, determinar o significado do cultivo de Aspergillus spp. em cultura é muitas vezes um desafio quando o exame microscópico do espécime é negativo. Em um levantamento de Aspergillus isolados de receptores de transplante de fígado e rim, Brown et al. descobriram que a presença de mais de duas colônias em uma cultura e infecção em mais de um local previu infecção significativa. Em pacientes granulocitopênicos com leucemia aguda, um único isolamento de uma amostra respiratória inferior deve ser considerado significativo. Relatos inequívocos de observações laboratoriais para o médico podem reduzir o dilema diagnóstico. Por exemplo, a afirmação “Um total de três colônias de Aspergillus fumigatus isoladas em duas de três placas” fornece mais informações do que “A. fumigatus isolado”.

Resultados otimizadores da cultura

Isolamento em cultura e identificação fenotípica de isolados clínicos comuns de Aspergillus spp. é geralmente rápido e fácil. No entanto, a cultura é frequentemente descrita como lenta, talvez criando conceitos errados sobre o seu valor para a detecção de Aspergillus spp. A. fumigatus é um cultivador rápido. As típicas colónias verde-azuladas aveludadas e cinzento-azuladas e as cabeças uniserianas conidiais desenvolvem-se em 24-48 h, tanto nos meios fúngicos como no ágar sangue de ovelha, comumente usado para cultura bacteriana. Outros aspergilli associados com aspergilose invasiva, especificamente, A. flavus, A. niger, A. nidulans, e A. terreus têm taxas de crescimento semelhantes às de A. fumigatus quando as colônias foram medidas em ágar extraído de malte e ágar de levedura de Czapek após incubação por sete dias a 25°C e 37°C . Como a resistência às drogas de alguns Aspergillus spp. é uma ameaça, a identificação completa, não só de A. fumigatus, mas também das espécies menos comumente isoladas, é justificada. Os cientistas de laboratório também devem reconhecer isolados atípicos de Aspergillus spp. Foram relatadas recentemente cepas pouco esportivas (brancas) de A. fumigatus com susceptibilidades reduzidas a várias drogas antifúngicas. Estas cepas brancas têm uma sequência genética diferente da do tipo selvagem, A. fumigatus Fresenius, e não conseguiram desenvolver cabeças conidiais típicas azul-esverdeadas até 10-12 dias após a incubação. Outro desafio é o bolor branco, Neosartorya fisheri, que inicialmente produz cabeças conidiais esparsas, parecidas com as de A. fumigatus. No entanto, N. fisheri desenvolve posteriormente numerosas cleistotécias redondas e de parede fina, tornando a diferenciação de A. fumigatus simples. Um escopo dissecante é útil para a localização rápida de cabeças conidiais e cleistotécias. Podem ocorrer isolados de A. fumigatus estéreis, brancos, de crescimento rápido ou glabros, montanhosos, de crescimento lento, que requerem testes de termotolerância e exoantigénio para identificação definitiva. Khan et al. relataram um A. atípico. terreus isolado de amostras respiratórias inferiores de um paciente com aspergiloma. As colônias iniciais eram alaranjadas e produziam um pigmento amarelo difusível e pequenas células únicas que eram confundidas com a conidia do Scedosporium apiospermum. Anticorpos precipitantes e cabeças conidiais típicas de A. terreus produzidos após 10 semanas de incubação confirmaram a identificação.

As imagens e informações disponíveis em livros didáticos e na Internet oferecem boas oportunidades educacionais para aprender a identificar Aspergillus spp. A experiência prática, entretanto, continua sendo a ferramenta de ensino mais eficaz. A CDC, a Rede Nacional de Formação Laboratorial (NLTN) e a CBS oferecem oficinas de laboratório. Quando as viagens para fora do local não são práticas, os laboratórios são encorajados a utilizar o tutorial online, Aspergillus Reference Cultures , para treinamento interno. Os organismos de referência ali listados estão disponíveis para compra nas principais coleções de cultura.

A análise de cada etapa do procedimento de cultura pode levar a uma melhor recuperação dos aspergillus. A liquefação de espécimes com Espartólisina ou outros agentes mucolíticos tem sido sugerida para a recuperação de fungos presos no muco da expectoração e material sinusal recuperado da cirurgia endoscópica. O uso de dextrose de batata, floco de batata, extrato de malte, ágar inibitório de bolor ou ágar de esporulação similar como meio primário de isolamento para Aspergillus spp. pode acelerar a taxa de crescimento e a produção de conidia. A adição de agentes antibacterianos aos meios de isolamento ajuda a reduzir o tempo de identificação, inibindo o crescimento excessivo de bactérias e reduzindo a necessidade de subcultura. A incubação inicial de meios fúngicos a 35-37ºC em vez de, ou em adição a, 30ºC pode acelerar o crescimento de alguns aspergilli . Da mesma forma, a inspecção diária dos meios de cultura assegura a detecção mais rápida possível. Ao incubar placas de cultura num ambiente microaerófilo a 35 °C, a Tarrand descobriu que Aspergillus spp. seleccionados e clinicamente importantes cresceram a partir de 12 das 12 culturas de caldo. Culturas dos mesmos organismos incubados a 25°C sem CO2 não produziram resultados positivos. Estudos adicionais seriam úteis para esclarecer os meios e condições mais eficazes para a recuperação e rápida identificação de aspergilli clinicamente importantes.

Com uma rápida montagem de fita adesiva ou chiclete, cabeças conidiais de Aspergillus spp. podem tipicamente ser identificadas. No entanto, uma cultura de lâminas pode ser necessária quando a esporulação é lenta ou atípica. O ritmo rápido da maioria dos laboratórios hospitalares dita o método mais fácil, embora não necessariamente o mais refinado, para a realização da cultura de lâminas. O método clássico de cultura de diapositivos da Riddell foi complementado com outras técnicas menos trabalhosas. Um método rápido é simplesmente empurrar uma lamela de 18 × 18 mm a um ângulo de 45 graus para um meio de esporulação, como o ágar em flocos de batata. Quando o molde é esporulado, a lamela é cuidadosamente retirada do ágar e montada em uma gota de azul lactofenol ou lacto-fucsina em uma lâmina de microscópio. Outra gota é colocada em cima da pequena lamela antes de completar a montagem com uma lamela de 22 × 22 mm.

Problemas de força de trabalho

Diagnóstico rápido da aspergilose depende não só de uma metodologia melhorada, mas também de uma força de trabalho adequada e bem treinada. As pesquisas sobre as práticas de micologia recomendam fortemente mais formação . Especial ênfase deve ser dada à identificação precisa, exame direto, uso apropriado dos meios, relevância clínica e custo-benefício. No entanto, um pessoal inadequado pode comprometer tanto a formação como a implementação de procedimentos clinicamente mais relevantes. O ASM Benchmarking Survey revelou uma contínua escassez de mão-de-obra para alguns laboratórios de microbiologia nos EUA. Em parte, a escassez resulta de uma redução de 53%-56% nos programas de treinamento de CLS nos últimos 12 anos. Trinta e quatro por cento dos profissionais que trabalham hoje em laboratórios de microbiologia têm mais de 50 anos de idade. Estarão os trabalhadores mais jovens disponíveis para os substituir quando se reformarem? Enquanto quase 80% das mulheres na força de trabalho têm menos de 30 anos, apenas 10% das trabalhadoras no laboratório de microbiologia têm menos de 30 anos. Estes dados sugerem que a escassez de mão-de-obra irá continuar e possivelmente exacerbar.

Conclusão

A melhoria dos procedimentos diagnósticos tradicionais e não tradicionais para micoses exige esforços simultâneos para assegurar uma mão-de-obra adequada e para melhorar a mobilidade na carreira, reconhecimento profissional, oportunidades de formação avançada, compensação e outros factores necessários para estimular o interesse na ciência laboratorial.