Elisabeth casou com Filipe II de Espanha filho de Carlos V, Santo Imperador Romano, e Isabel de Portugal em 1559. Casado originalmente por procuração em Notre Dame (com o Duque de Alba em posição de Filipe) antes de deixar a França, a cerimónia propriamente dita teve lugar em Guadalajara, Espanha, à sua chegada. O casamento foi resultado da Paz de Cateau Cambrésis (1559). Sua segunda esposa, Maria I da Inglaterra, havia falecido recentemente, fazendo de Elisabeth de Valois Philip terceira esposa.
Em seu casamento ela conheceu a pintora Sofonisba Anguissola, e Ana de Mendoza, que viveria com ela o resto de sua vida. Filipe II nomeou Anguissola para ser uma dama de companhia e pintora da corte para sua rainha. Sob a tutela de Anguissola, Elisabeth melhorou suas habilidades de pintura amadora. Anguissola também influenciou as obras artísticas de seus filhos, Isabella Clara Eugenia e Caterina Michaela, durante seu tempo na corte.
Philip estava completamente encantada por sua noiva de 14 anos, e em 1564 havia desistido de suas infidelidades. Apesar da significativa diferença de idade, Elisabeth também estava bastante satisfeita com seu marido (em cartas à mãe, ela se proclamou afortunada por ter casado com um príncipe tão charmoso). Philip gostava de organizar torneios de cavalheirismo para entreter sua esposa. Elisabeth fazia de senhorita aos três jovens príncipes da corte espanhola: Carlos, Príncipe das Astúrias, João da Áustria (filho ilegítimo de Carlos V), e Alexandre Farnese, Duque de Parma (filho da filha ilegítima de Carlos V, Margarida).
Elisabeth tinha sido noiva do filho de Felipe, Carlos, Príncipe das Astúrias, mas complicações políticas inesperadamente exigiam, em vez disso, um casamento com Felipe. A sua relação com o seu enteado perturbado Carlos era calorosa e amigável. Apesar dos relatos de seu comportamento progressivamente bizarro, Carlos foi sempre gentil e gentil com Elisabeth. Quando finalmente se tornou necessário que Philip o prendesse (o que logo levou à morte do Príncipe), Elisabeth chorou por dias.
Philip era muito apegado a Elisabeth, permanecendo perto dela mesmo quando ela estava doente com varíola. A primeira gravidez de Elisabeth em 1560 resultou em um filho natimorto, seguido em 1564 por um aborto espontâneo de meninas gêmeas. Mais tarde, ela deu à luz a Infanta Isabella Clara Eugenia, da Espanha, no dia 12 de agosto de 1566, e depois à irmã mais nova de Isabella, Catherine Michelle, da Espanha, no dia 10 de outubro de 1567. Phillip e Elisabeth eram muito próximas de suas filhas, comprando geléias, bonecas, brinquedos e muito mais. Diz-se que “ambos se alegraram com o nascimento de Isabel como se tivesse sido o nascimento de um filho”. Elisabeth teve outro aborto a 3 de Outubro de 1568, e morreu no mesmo dia, juntamente com a sua filha recém-nascida.
Após a morte de Elisabeth, Catherine de’ Medici ofereceu a sua filha mais nova, Margaret, como noiva para Filipe. Philip recusou a oferta.