Desde as descobertas seminais dos princípios básicos subjacentes à clonagem molecular, Foram desenvolvidas várias estratégias de clonagem para melhorar a facilidade e a velocidade com que os fragmentos de ADN podem ser recombinados. Leia sobre as estratégias mais comuns usadas na clonagem molecular ou obtenha o gene desejado no vetor que você deseja da maneira mais fácil com os clones do GenEZ™ ORF. Comece com uma busca por seu gene.
Clonagem Tradicional
Clonagem Tradicional, também chamada de clonagem PCR, requer o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a seqüência do modelo de interesse (geralmente o gene de interesse) e adicionar locais de restrição às extremidades da seqüência. As enzimas de restrição são usadas para cortar tanto o modelo de interesse como o vector alvo, e a ligase de ADN é usada para unir as extremidades pegajosas do modelo e do vector. A clonagem tradicional permite a manipulação da sequência de ADN flexible, o que facilita a construção de praticamente qualquer construção desejada. No entanto, os pontos de verificação e os procedimentos de optimização necessários para a clonagem tradicional podem ser pesados, e os reagentes necessários podem ser caros.
TTA Clonagem
TTA clonagem é uma das formas mais simples de clonagem. Neste método, são utilizados vectores que contêm sobreposições de 5′ de timina para aceitar produtos PCR nos quais foram adicionadas sobreposições adicionais de 3′ de adenosina pela natureza da polimerase TAQ amplification. A clonagem TA tem a vantagem de ser fácil e rápida, uma vez que não é necessária nenhuma etapa de digestão restritiva. Além disso, os kits de clonagem TA contêm buffers de reação que contêm o vetor pré-misturado, ligase e tampão, cortando o tempo de reação de ligadura até apenas 5 minutos. A desvantagem da tecnologia de clonagem TA é que a clonagem não é direcional, o que significa que o gene de interesse pode ser inserido no vetor alvo no sentido ou na orientação antisense. Normalmente, metade dos transformadores subsequentes conterá o gene na direcção do sentido e a outra metade conterá o gene na direcção do antisenso. No entanto, as células transformadas com genes tóxicos podem todas exibir os genes na direção do anti-senso, uma vez que as células que contêm os genes direcionados para o sentido não sobreviverão. Além disso, células sobreviventes contendo genes tóxicos orientados na direção do sentido podem ser mutadas para codificar uma proteína menos tóxica.
Clonagem sem emenda
Tecnologias de clonagem sem emenda eliminam a exigência de enzimas de restrição. Isto pode ser vantajoso quando um insert contém uma série de sites de restrição dentro da sua sequência, tornando-o difficult para identificar as enzimas de restrição que não irão cortar o gene de interesse durante o procedimento de clonagem. A clonagem sem costura tira vantagem da recombinação homóloga e há numerosas variações na técnica. Em geral, o procedimento consiste em adicionar sequências flanking com cerca de 15 bp de comprimento tanto à inserção como ao vector via PCR. As exonucleases são usadas para mastigar as sequências de inserção e vector e o ADN é unido usando enzimas recombinase ou ligase de ADN. A clonagem sem juntas foi simplified através do desenvolvimento de kits que já contêm o vector alvo e uma mistura proprietária de enzimas necessárias para a reacção de recombinação. Por exemplo, o kit GenBuilder™ do GenScript pode clonar inserções de até 10 kb em 30 minutos, e também pode ser usado para projetos de clonagem de alto rendimento.
