Conservação de CTL4/CTLMA2 em Anopheles
CTL4 e CTLMA2 ambos consistem de um peptídeo de sinal, uma seqüência N-terminal curta contendo o motivo CXCXC, e um único domínio CTL. Um relatório recente sugeriu que a função de CTL4 e CTLMA2 ou seus cofatores divergiram dentro de Anopheles, e especificamente que An. albimanus CTL4 não contém os resíduos de cisteína N-terminal envolvidos nas ligações de dissulfeto22. Reexaminamos primeiro os ortologs de CTL4 (AGAP005335) e CTLMA2 (AGAP005334), os quais têm uma orientação próxima ao cromossomo 2L (Fig. 1a), usando os modelos genéticos atuais (a partir de fevereiro de 2019) em Vectorbase24. Encontramos proteínas com um motivo N-terminal CXCXC para 15/16 ortologs CTL4, incluindo An. albimanus AALB014534, e 13/14 ortologs CTLMA2. Realizamos alinhamentos sequenciais múltiplos de CTL4 e CTLMA2 de 10 espécies de Anopheles asiáticos, africanos e do Novo Mundo (Fig. 1b). As árvores filogenéticas não enraizadas têm topologia quase idêntica, e uma árvore filogenética combinada tem dois ramos simétricos, exceto pela posição de An. dirus em relação a An. funestus e An. maculatus.
Conservação de CTL4 e CTLMA2 em Anopheles. (a) Esquema ilustrando o arranjo back-to-back de An. gambiae CTL4 e CTLMA2 no cromossomo 2 L. (b) Árvores filogenéticas não enraizadas para CTL4 (azul), CTLMA2 (vermelho) em dez espécies de Anopheles incluindo An. gambiae (roxo) e An. albimanus (ciano). A porção N-terminal de ambos os alinhamentos multi-sequências é mostrada com resíduos conservados de cisteína destacados em amarelo, outros resíduos conservados destacados em cinza. O motivo CXCXC é conservado em todas as sequências, exceto aquelas truncadas no N-terminus.
Isto suporta a hipótese de que CTL4 e CTLMA2 são conservados dentro do gênero Anopheles, com ortologs ausentes refletindo anotação incompleta de certos genomas. Examinamos a região genômica de três espécies com um ortolog CTL4 relatado, mas nenhum ortolog CTLMA2: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, e An. melas AMEC014491. Todos possuem um gene próximo ou sobreposto em orientação inversa – ASTE002636, AMIN007379 e AMEC088499, compreendendo dois domínios CTL. Para An. stephensi e An. minimus o segundo CTL é precedido por um motivo CXCXC, sugerindo que eles podem ser ortologs CTLMA2. Nos mosquitos Aedes e Culex, a situação é menos clara. Um ortolog CTLMA2 incluindo um motivo CXCXC terminal N é anotado em Ae. albopictus, AALF001196, e tem um gene de dois exon invertido de perto AALF001195, composto por uma protease serina e um domínio CTL. O modelo do gene Ae. aegypti de outubro de 2018 inclui um ortolog CTLMA2 com motivo N-terminal CXCXC, CTLMA14 (AAEL014382), atualmente listado como um ortolog CTL4). Um ortograma CTLMA2 é anotado em C. quinquefasciatus, CPIJ000443, mas não tem o motivo CXCXC terminal N. Isto sugere que CTLMA2 surgiu em um ancestral comum de Anopheles e Aedes, enquanto CTL4 pode ser específico de Anopheles.
Caracterização Bioquímica
An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 e CTLMA2 CRDs (Fig. S1a), e An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) foram expressos em células de insetos usando o sistema vetorial de expressão do baculovírus (BEVS) e purificados para homogeneidade. O AgCTL4 maduro (25-177) tem uma massa molar de 17,3 kDa e pI 7,7. O AgCTLMA2 maduro (18-174) tem uma massa molar de 17,9 kDa e pI 4,5. O heterodímero purificado tem um peso molecular em SDS-PAGE não redutor (NR) de 35 kDa (Fig. 2a) e elui como um único pico em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um peso molecular aparente de 40 kDa (Fig. 2b). CTL4 e CTLMA2 monoméricos aparecem na redução de SDS-PAGE em 17 kDa e 20 kDa, respectivamente. Como anteriormente observado, o aumento do peso molecular aparente de CTLMA2 pode refletir sua distribuição incomum de aminoácidos (ácidos)20,
Caracterização bioquímica de CTL4/CTLMA2 recombinante. (a) Purificado An. gambiae CTL4/CTLMA2 heterodímero em não redutor (NR) e redutor (R) SDS-PAGE. Representante de >10 experimentos independentes. (b) Cromatograma de troca aniônica (MonoQ 10/10) e de exclusão de tamanho (Superdex75 16/60) para An. gambiae CTL4/CTLMA2. Os carrapatos pequenos indicam as frações SDS-PAGE que os acompanham, os carrapatos grandes indicam os padrões SEC MW. Representante de >10 experimentos independentes. (c) α6 × His (CTL4) e αCTLMA2 Western blotting para nove mutantes de cisteína do heterodímero CTL4/CTLMA2 em não redutor (NR) e redutor (R) SDS-PAGE. Em todos os mutantes a formação do heterodímero é evidente, embora menos eficiente. Representante de três experimentos independentes. (d) Lote de C(s) vs. s para velocidade de sedimentação ultracentrifugação analítica de 1 mg/ml de CTL4/CTLMA2, NaCl 200 mM, HEPES 20 mM pH 7,5. Três picos de coeficiente de sedimentação crescente são observados, s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Representante de três experimentos independentes. (e) Dispersão dinâmica da luz de CTL4/CTLMA2 vs. pH. Os dados são ajustados a uma partícula esférica cujo raio reflete a distribuição de tamanho em solução, nenhuma tendência é aparente na faixa de pH 6-9,5 para An. gambiae ou An. albimanus CTL4/CTLMA2 em 1 mM EDTA ou 10 mM CaCl2. Resultado de um dos dois experimentos independentes.
Foi demonstrado que o An. gambiae CTL4/CTLMA2 é estabilizado por um dissulfeto intermolecular entre cisteínas do motivo N-terminal CXCXC; mutação dessas três cisteínas para a formação de bissulfeto inter-cadeia de abortos de alanina20. Para refinar ainda mais a localização do dissulfureto entre cadeias, construímos nove mutantes contendo uma única cisteína no motivo N-terminal CXCXC do CTL4 e CTLMA2, coexpressámos as proteínas nas células Sf9, e realizámos o Western Blotting para detectar CTL4 e CTLMA2. A formação de dissulfeto intermolecular foi ineficiente, mas evidente na não redução da SDS-PAGE em todos os casos (Fig. 2c).
O que sugere que a formação de dissulfeto intermolecular N-terminal entre CTL4 e CTLMA2 é promíscua, ao invés de envolver um resíduo específico de cisteína de cada proteína. Se a formação de dissulfureto intermolecular for promíscua, os heterodímeros CTL4/CTLMA2 poderiam, em princípio, formar oligómeros com pontes de dissulfureto multivalentes. No entanto, não são detectados oligómeros dissulfurados em NR-SDS-PAGE para An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Fig. 2a). Da mesma forma, enquanto CTL4 e CTLMA2 podem formar homodímeros com ponte dissulfídica in vitro20, o produto purificado é esmagadoramente (>95%) heterodímero. Algumas bandas menores (~10%) são observadas na NR-SDS-PAGE para An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) que podem representar homodímeros ou formação de oligómeros.
Both An. gambiae CTL4/CTLMA2 e An. albimanus CTL4/CTLMA2 são polidispersíveis em solução. A oligomerização não covalente de ordem superior é evidente como um ombro do pico principal na SEC com concentração crescente, e é mais pronunciada para An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Foi confirmada a existência de espécies oligoméricas por sedimentação-velocidade ultracentrifugação analítica (AUC) (Fig. 2d). A pH 7,5 uma série de espécies de intensidade decrescente é observada na distribuição c(s): s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. A oligomerização é independente de Ca2+ para A. gambiae CTL4/CTLMA2 mas aumenta substancialmente com Ca2+ para A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), e não está correlacionado com o pH de acordo com a dispersão dinâmica da luz (DLS) (Fig. 2e).
Calcium binding
As CTLs, tanto CTL4 como CTLMA2 podem ligar o cálcio. Entretanto, os resíduos de ligação canônica Ca2+ em CTL4 são mutantes, sugerindo que pode ser um CTLD, mas não um CRD tipo C. Assim, medimos a afinidade de ligação do cálcio de An. gambiae CTL4, CTLMA2 e o heterodímero CTL4/CTLMA2 de An. gambiae e An. albimanus por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Em condições equivalentes, a ligação foi observada para CTLMA2 e CTL4/CTLMA2, mas não para CTL4 (Fig. 3a-c). Constantes de ligação e parâmetros termodinâmicos foram calculados a partir dos resultados de três experimentos independentes (Tabela 1). A ligação CTLMA2 Ca2+ é bem ajustada por um único modelo local com KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. A afinidade de An. gambiae CTL4/CTLMA2 para cálcio é ~40 × superior ao CTLMA2 com KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) tem uma afinidade semelhante para o cálcio com KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Entretanto, a ligação do cálcio tanto para An. gambiae quanto para An. albimanus CTL4/CTLMA2 foi subestoquiométrica (N = 0,36-0,50).
ITC binding isotherm for calcium binding. (a) An. gambiae CTL4, (b) An. gambiae CTLMA2, (c) An. gambiae CTL4/CTLMA2.(d) An. albimanus CTL4/CTLMA2. A concentração de proteínas na célula foi de 100 μM, a concentração de Ca2+ (CaCl2) na seringa foi de 2,5 mM para monômeros, 1,25 mM An. gambiae CTL4/CTLMA2, 0,8 mM para An. albimanus CTL4/CTLMA2. Nenhuma ligação é evidente para o CTL4, ligação fraca para o CTLMA2 e ligação apertada para o CTL4/CTLMA2. Representante de três experiências independentes.
Aglutinação de glicosídeos
CTL4 e CTLMA2 pertencem à linhagem de CTL mielóide – incluindo receptor de manose de macrófagos (MMR) e DC-SIGN – que formam uma família conservada de receptores imunológicos em metazoários15,25. Entre os CTLs com estrutura conhecida, o CTLMA2 possui 30% de identidade sequencial para o domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) do receptor do catador do rato (SCRL, PDB ID 2OX9)26 e proteína surfactante porcina D (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 conserva os resíduos associados à ligação de Ca2+ no laço de ligação da glicose, e o motivo EPN canônico associado à seletividade da manose D (Fig. 4a). Em contraste, o CTL4 carece de todos os resíduos associados à ligação de Ca2+, consistente com o fato de que nenhuma ligação foi observada pelo ITC. A única CTL de estrutura conhecida com considerável semelhança com CTL4 é a proteína de ligação fator IX/X (X-bp) do veneno do mocassim chinês Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp é um CTLD modificado no qual o domínio de ligação da glicina é substituído por um loop longo que medeia a dimerização para gerar o fator IX/X local de ligação. Assim, embora alguns CTLs de insetos não necessitem de cálcio para a ligação de glicosídeos, não está claro se CTL4 deve ligar glicosídeos.
Dados de dispersão de solução e modelo para CTL4/CTLMA2. (a) Alinhamento sequencial para An. gambiae e An. albimanus CTL4 e CTLMA2 com o receptor do rato CTLD (SCRL, PDB ID 2OX9) e proteína surfactante porcina D (SP-D, PDB ID 4DN8). Os resíduos conservadosdenticamente são destacados com preto. Os resíduos do laço de ligação Ca2+/glycan são destacados em rosa. Os resíduos do laço básico do CTL4 1 são destacados em azul, os resíduos do laço ácido do CTLMA2 1 são destacados em vermelho. (b) Modelo molecular para CTL4 (verde) e CTLMA2 (laranja). Laço de ligação Ca2+/glycan destacado em cor-de-rosa. Cisteínas em ligações de dissulfeto mostradas como paus amarelos. Com base na proximidade do motivo CXC terminal N para formar um dissulfureto intermolecular, a orientação provável dos CRDs no heterodímero CTL4/CTLMA2 teria laços de ligação Ca2+/glycan voltados para o exterior e laços de ligação voltados para o interior. (c) Curva de dispersão de raios X de pequeno ângulo para A. gambiae CTL4/CTLMA2. (inset) Traçado Guinier (PRIMUS), RG = 24,5 Å. (d) Distribuição P(r) (GNOM), Dmax = 80 Å. (inset) ajuste à curva de dispersão, RG = 25,4 Å. (e) Modelos CTL4/CTLMA2 decorrentes de um ajuste de 3 estados à curva de dispersão (MULTIFOXS). Um modelo está alinhado com o mais provável dos 20 modelos de contas ab initio que se ajustam à distribuição P(r) (DAMMIF). Medidas derivadas de um único experimento.
Para definir sua atividade lectin, analisamos CTL4, CTLMA2 e o heterodímero CTL4/CTLMA2 em matrizes de glicoscópio que exibem 367 estruturas únicas de glicoscópio28. Estes estudos demonstraram a ligação a uma gama de latas de glicanos (Tabela 2). Os monómeros de CTL4 e CTLMA2 demonstraram ligação a apenas quatro e seis latas de glicanos, respectivamente, enquanto que o heterodímero ligou 18 latas de glicanos diferentes. Existe uma diferença apreciável entre os ligantes ligados pelos monómeros individuais e o heterodímero; 3/4 (75%) das latas de glicanos reconhecidas por CTL4 e 2/6 (33%) das latas de glicanos reconhecidas por CTLMA2 não foram reconhecidas por CTL4/CTLMA2.
Para confirmar os resultados do array de glicanos e determinar as preferências de ligação para as CTL, foi realizada a análise SPR (Tabela 3). Em quase todas as interações a matriz de glicosilanos e SPR estavam de acordo com a presença de interações com a SPR indicando que a matriz de glicosilanos tinha quatro resultados falsos negativos: Monômero CTLMA2 com antígeno H, sulfato de condroitina e sulfato de condroitina-6, e monômero CTL4 com sulfato de condroitina-6. Entretanto, todos os resultados falsos negativos mostraram ligação no array com o heterodímero CTL4/CTLMA2.
Os CTL não reconheceram as latas de glicosídeos contendo manose-6, com exceção do manose-6-fosfato por CTL4/CTLMA2, apesar do motivo EPN canônico presente no CTLMA2. Ao contrário, as estruturas reconhecidas são geralmente motivos glicosaminoglicanos (GAG) compreendendo β1-3/β1-4 ligações entre glicose (Glc), galactose (Gal) e suas respectivas hexosaminas GlcNac e GalNac. A ligação Galβ1-4Glc estava presente em 12/23 (52%) das glucanas reconhecidas, incluindo 6/23 (26%) contendo Galβ1-4GlcNac e 4/23 (17%) contendo o motivo queratana Galβ1-4GlcNac β1-3Gal ou GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.
A matriz também mostrou alguma preferência por glucanas poliméricas e sulfatadas. Das quatro glico latas reconhecidas pelo CTL4, a mais forte foi para globopentaose (Gb5, Galβ1-_3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 também ligou HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n e β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Três das cinco glucanas reconhecidas pelo monômero CTLMA2 foram sulfatadas, e o heterodímero CTL4/CTLMA2 reconheceu sulfato de condroitina e sulfato de condroitina-6, ácido hialuroninc (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8, e HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Estes resultados sugerem que existem efeitos distintos e sinérgicos da heterodimerização na ligação de glicosídeos.
Both CTLMA2 e o heterodímero CTL4/CTLMA2 reconhece vários açúcares contendo fucos, incluindo sialil-LewisX e sulfo-LewisA, mas não sialilil-LewisA. A maior afinidade de ligação foi observada para sulfo-LewisA com ligação ao complexo CTLMA2 (106 nM) e CTL4/CTLMA2 (95 nM) a um KD de ~100 nM (Tabela 3). A maior ligação de afinidade observada para CTL4 foi também para um glicoscano sulfatado, sulfo-lactosamina (292 nM).
Análise estrutural
Para aprofundar a sondagem da estrutura de CTL4 e CTLMA2, geramos modelos estruturais de CTL4 e CTLMA2 (Fig. 4b) usando MODELLLER29 com edição manual adicional. Tanto a CTL4 como a CTLMA2 possuem um laço estendido (loop 1) após a segunda hélice da CTLD (Fig. 4a) com alta densidade de resíduos carregados complementares; resíduos básicos para CTL4 e resíduos ácidos para CTLMA2. A eletrostática complementar desses resíduos da alça 1 e sua proximidade com o motivo CXCXC terminal N sugere que se trata de uma interface proteína/proteína potencial dentro do heterodímero (Fig. 4b), para a qual foi gerado um modelo hipotético com uma única ligação de dissulfeto no motivo CXCXC. No entanto, os laços de ligação glucano/Ca2+ são uma segunda interface potencial, como observado para as duas cadeias de D. acutus X-bp. A hipótese alternativa é que os dois domínios CTL são independentes um do outro, com ligadores flexíveis unindo-os através da hipótese intermolecular.
Para testar esta hipótese, analisamos a estrutura da solução de CTL4/CTLMA2 por espalhamento de raios X de pequeno ângulo (SAXS). Foram realizados experimentos em NaCl 0,5 M, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2, e 1% glicerol para minimizar as interações interpartículas. Nestas condições, a proteína apresentou uma relação linear entre a intensidade extrapolada em ângulo zero e concentração (I0 vs. c) até uma concentração de 3,1 mg/ml. A curva tampão-subtraída de intensidade I vs. q (Fig. 4c) foi submetida ao SAXSMoW2 que rende RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) e peso molecular MW = 39 kDa, apenas 11% maior do que o heterodímero esperado MW de 35 kDa30. No entanto, o gráfico Guinier calculado é baseado em apenas sete pontos de dados; o ajuste ao longo de um intervalo alargado (Fig. 4c, inset) produz RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), enquanto que o ajuste da função de distribuição par a par P(r) (Fig. 4d) produz um RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). A distribuição P(r) encaixa por DAMMIF31 com 20 modelos de contas ab initio com uma discrepância estrutural média normalizada NSD = 1,0 ± 0,2. O corpo principal dos modelos ab initio são semelhantes em forma ao heterodímero CTL4/CTLMA2 esperado.
Densidade adicional se estende do corpo principal dos modelos de esferas que podem refletir ou a seqüência N-terminal de ambas as proteínas incluindo o motivo CXCXC, ou uma população menor de CTL4/CTLMA2 com uma giração de raio maior. Para testar esta hipótese, realizamos a modelagem multi-estados do perfil SAXS com o programa MULTIFOXS32. Geramos um modelo completo para CTL4-6xHis/CTLMA2 com uma bobina N-terminal terminada por um dissulfeto intermolecular entre CTL4 C39 e CTLMA2 C34. MULTIFOXS gerou um conjunto de 10.000 variantes do modelo para comparar com a curva de dispersão experimental. Os únicos resíduos flexíveis foram CTL4 40-45 e 178-183 (6xHis) e CTLMA2 35-39, com uma bobina N-terminal enrolada servindo como um corpo rígido ligando as duas correntes. O melhor modelo de um estado encaixa nos dados com χ2 = 1,13 e teve RG = 23,7 Å. O mínimo χ2 = 1,07 foi alcançado com um modelo de 3 estados (Fig. 4e), no qual 80% da dispersão é contribuída por dois modelos compactos com RG = 22,0 Å e RG = 23,7 Å. Estes dados são consistentes com a formação de um heterodímero compacto entre CTL4 e CTLMA2.
CTL4/CTLMA2 inibem a ativação de fenol oxidase em resposta à E. coli
CTL4 e CTLMA2 funcionam como inibidores da resposta da melanização do mosquito à infecção. Foi relatado anteriormente que a derrubada de CTL4 não levou ao aumento da atividade da fenol oxidase (PO) em resposta à infecção com uma mistura de E. coli e S. aureus20. O mesmo estudo, entretanto, descobriu que os mosquitos dsCTL4 e dsCTLMA2 eram especificamente suscetíveis a bactérias Gram-negativas. Assim, nós reexaminamos o efeito da derrubada de CTL4 e CTLMA2 na atividade da hemolinfa PO em resposta apenas à infecção por E. coli (Fig. 5a). Às 4 h pós-infecção com E. coli, a atividade PO foi significativamente aumentada para os mosquitos dsCTL4 (p = 0,02) e dsCTLMA2 (p = 0,004) em comparação com os controles dsLacZ (Fig. 5b). A eficiência média de derrubada para CTL4 e CTLMA2 foi de 93 ± 3% e 89 ± 3%, respectivamente, com >80% em qualquer experimento.
Recombinante CTL4/CTLMA2 inibe a atividade da fenoloxidase (PO) após o desafio da E. coli (a) Desenho experimental para medir a atividade da hemolinfa PO 4 h após o desafio da E. coli (DO 0,8). A atividade PO foi determinada pela medida de A492 1 h após a combinação da hemolinfa com o substrato L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), como descrito nos Materiais & Métodos. (b) Aumento da atividade da hemolinfa E. coli-induzida na atividade de PO de dsCTL4 e dsCTLMA2. *0,017, **0,0035 (n = 3, teste de comparação múltipla de Tukey) (c) A derrubada simultânea do TEP1 (dsTEP1), em comparação com o controle LacZ (+BSA), reverte o aumento da atividade de E. coli-induced hemolymph PO em dsCTL4 mosquitos. ***0.001 (dsCTL4/dsLacZ vs. dsLacZ/dsLacZ), ***0.006 (dsCTL4/dsTEP1vs. dsCTL4/dsLacZ) (n = 3, teste de comparações múltiplas de Tukey). (d) A co-administração de CTL4/CTLMA2 recombinante (+CTLs), em comparação com o controle de BSA (+BSA), reverte o aumento da atividade da hemolinfa E. coli-induzida no mosquito dsCTL4. **0,007, **** 1,8 × 10-5 (n = 3, teste t de aluno heterocedástico de duas caudas). As barras representam média ± DP com p ≤ 0,05 considerado significativo.
Melanização de ookinetes plasmódicos sobre o silenciamento CTL4/CTLMA2 é dependente de LRIM117,22, TEP133 e SPCLIP133. Como todos estes são elementos da resposta imunológica tipo TEP1, raciocinamos que uma maior atividade PO na ausência de CTL4 deve ser dependente de TEP1. Assim, comparamos o aumento da atividade PO no mosquito dsCTL4 com a co-administração do dsTEP1 com a co-administração do dsLacZ (Fig. 5c). A eficiência média de derrubada para TEP1 foi 82 ± 9% e >80% em experimentos 5/6 (64% em um experimento). De facto, não houve um aumento significativo da actividade PO nos mosquitos dsCTL4 quando o TEP1 também foi silenciado. Isto confirma que a melanização na ausência de CTL4/CTLMA2 é dependente de TEP1.
Co-administração de CTL4/CTLMA2 recombinante com E. coli reverteu significativamente o aumento da atividade PO nos mosquitos dsCTL4 em comparação com BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Estes resultados demonstram que a CTL4/CTLMA2 está diretamente envolvida como um regulador negativo da atividade PO. No entanto, nos mosquitos dsLacZ, o CTL4/CTLMA2 não suprimiu a actividade PO induzida por E. coli em comparação com a albumina de soro bovino (BSA). Além disso, a atividade de E. coli induzida por PO nos mosquitos dsCTL4 co-injetados com o recombinante CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTLs) foi maior que a dos mosquitos dsLacZ co-injetados com BSA (dsLacZ + BSA). Portanto, a injeção de CTL4/CTLMA2 recombinante não resgata completamente a perda de proteína endógena.