Junho 1, 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Fundadora e Escritora Principal DeeAnn Visk Consulting
Terapia Genética Deve Quebrar Rampartes Celulares sem Reagir à Queda de Jericó em Miniatura
Imunoterapias contra o câncer, vacinas contra novos vírus (ou vírus antigos em novos lugares), e tentativas de resolver defeitos patogênicos unicelulares – todos estão procurando incorporar tecnologia de transfecção. Esta tecnologia, que engloba vários meios de introduzir ácidos nucleicos nas células, é muito promissora, mas também apresenta sérios desafios.
Estes desafios têm sido mais proeminentes nas tentativas de implantar a terapia genética, que tem tido dificuldades em resolver o problema de células, órgãos e animais inteiros difíceis de transferir.
Tantos desafios de transfecção têm sido enfrentados por várias empresas de biotecnologia. Por exemplo, MaxCyte, Lonza e Mirus Bio oferecem a eletroporação como um método que deixa poucos resíduos. A electroporação, acontece, não é adequada para o uso com todos os animais, por isso são necessários outros métodos. Uma técnica alternativa é a infecção viral. Está sendo empregada por empresas como GenVec.
Um outro desafio, particularmente relevante para a transfecção viral, é o potencial para estimular uma resposta imunológica. Este potencial negativo pode ser realmente positivo, no entanto, no contexto certo, o que acontece com o desenvolvimento de vacinas. O aproveitamento de abordagens de transfecção viral para os mecanismos de vacinação energética é uma especialidade da Thermo Fisher Scientific. A empresa também oferece transfecção tradicional de base química que funciona em todo o animal.
Todos juntos, as empresas mencionadas até agora oferecem tecnologias que cobrem todos os principais modos de transfecção terapeuticamente relevantes: transfecção de base química, métodos não químicos (principalmente electroporação), e transdução viral. Abordagens híbridas também estão sendo desenvolvidas, como ficará claro nas seções seguintes.
Electroporação
A plataforma de eletroporação da MaxCyte é compatível com GMP e perfeitamente escalável desde a pesquisa até a escala comercial. “Nosso sistema de eletroporação de fluxo permite que um milhão a várias centenas de bilhões de células sejam transferidas em menos de 30 minutos em um sistema fechado totalmente automatizado”, expõe Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. “Nosso sistema é compatível tanto com a ISO 9000 quanto com a FDA, portanto pode facilmente acomodar as necessidades de fabricação de nível terapêutico.
“Colaboramos rotineiramente com empresas farmacêuticas e biotecnológicas para desenvolver terapias de células-tronco e imunológicas de engenharia ex vivo. Por vezes o objectivo é fabricar rapidamente vacinas e medicamentos biológicos de alto rendimento, tais como anticorpos. Outras vezes, permitimos que os clientes criem uma produção em grande escala de vetores virais de alto rendimento utilizando células em suspensão e aderentes. Esta capacidade de processar células em grande ou pequeno número permite aos cientistas da bancada desenvolver um protocolo de processo usando eletroporação de fluxo para números pequenos de células. A ampliação deste processo é, então, sem problemas, sem as habituais dores de cabeça de manter a qualidade, uma vez que o processo de transfecção permanece o mesmo.
“Esta redução do risco é muito atractiva para os nossos parceiros. Assegurar a consistência da pesquisa, para a clínica, para a escala comercial, e de corrida em corrida, doador a doador, e paciente a paciente é fundamental para a eficácia das terapias de pastoreio através do processo de desenvolvimento”, afirma Dr. Peshwa.
Embora as abordagens químicas e lipídicas funcionem bem na pesquisa com linhas celulares estabelecidas, muitas vezes há consequências imprevistas da transfecção de células primárias. Além disso, estes meios químicos tradicionais de transfecção de células são difíceis de escalar até a produção industrial.
Electroporação, a abordagem não viral empregada pela MaxCyte, permite que a biologia das células transfectadas permaneça em um estado mais natural em qualquer escala. Ao evitar consequências não intencionais durante o processo de transfecção, a tecnologia da MaxCyte pode evitar a criação de bloqueios e ao mesmo tempo resolver a necessidade de alta eficiência transfeccional.
“Estas intervenções terapêuticas precisam ser praticamente garantidas para ter um impacto negativo mínimo não intencional sobre as células que estão sendo modificadas – toda a biologia deve ser a mesma durante cada etapa do processo”, insiste o Dr. Peshwa. “Além disso, nosso sistema de eletroporação de fluxo pode ser usado de forma automatizada. Ele já é usado rotineiramente no Japão para tratamentos terapêuticos comerciais e está em vários estágios de adoção em todo o mundo”
Outra consideração é onde a transfecção ocorre”. As células colhidas de um paciente são transportadas para outra cidade para processamento? O que acontece quando uma embalagem é perdida, ou atrasada, ou sofre flutuações de temperatura? A plataforma oferecida pela MaxCyte oferece a oportunidade de desenvolver uma nova terapêutica através do processamento das células dos pacientes no local, contornando as principais questões logísticas e de COGS (custo dos bens vendidos) de outros métodos.
Células de engenharia é fundamental para o desenvolvimento de uma terapêutica baseada em células. O sistema de eletroporação da MaxCyte pode evitar a modificação não intencional do fenótipo celular e, ao mesmo tempo, atender as principais necessidades dos desafios da engenharia celular: eficiência, consistência, portabilidade e escalabilidade, de acordo com a empresa.
Transduções virais
Vetores virais são especialmente úteis para a tranfecção de animais inteiros ou para uso com tecidos que podem ser de difícil acesso através de abordagens químicas ou de eletroporação. GenVec é especializado no uso de vetores virais, especificamente o adenovírus, para fornecer genes para fins terapêuticos.
“No primeiro blush, os problemas associados com a resposta imunológica aos vetores virais parecem ser problemáticos”, explica Doug Brough, Ph.D. “No entanto, descobrimos que isto pode ser usado para estimular uma resposta imunológica a materiais estranhos, de modo que os adenovírus poderiam ser empregados para fornecer vacinas”.
Indeed, GenVec estudou minuciosamente o adenovírus e gerou vários “sabores” diferentes de adenovírus. Ao explorar adenovírus em outras espécies, como gorilas e macacos, os investigadores podem usar vetores que são projetados para evitar a imunidade pré-existente que a população humana em geral tem de adenovírus.
“A grande biblioteca de vetores oferecida pelo GenVec é chamada de Adenoverse™”, informa o Dr. Brough. “Eliminamos grandes seções do adenovírus para limitar a toxicidade inata associada ao tratamento com adenovírus”. Além de prevenir uma resposta imune deletéria ao vetor, isto nos permite encaixar até 12 kb no vírus”
Utilizando uma variedade de abordagens, GenVec tem trabalhado com uma série de empresas em diferentes aplicações, terapêutica de ácidos nucléicos e tecnologias de edição de genes. Os adenovírus modificados podem fornecer abordagens de dedos de zinco, tanto in vitro como in vivo.
Um exemplo de uma dessas colaborações é encontrado com o ensaio clínico Novartis para regenerar células sensoriais no ouvido interno. “Ao infectar células do ouvido interno com um gene que codifica uma proteína reguladora chave, novas células mecanosensoriais podem ser geradas para substituir as perdidas devido a lesões ou condições genéticas inerentes”, explica o Dr. Brough.
Outros projetos conjuntos podem ser encontrados com parcerias em entidades para tratar o câncer e desenvolver vacinas. Quando chega a hora de comercializar uma tecnologia, a GenVec usa uma linha celular previamente aprovada pelo FDA para essas aplicações”, esclarece o Dr. Brough.
“Outra vantagem óbvia do uso de adenovírus é que eles podem prontamente transfetar animais inteiros”. Por exemplo, uma doença devastadora em animais de fazenda, chamada febre aftosa, é perpetuada por uma variedade de virotipos. Nosso sistema poderia permitir a troca rápida de qualquer estirpe que esteja causando um surto e permitir que uma vacina feita sob medida seja entregue rapidamente”, descreve o Dr. Brough.
Nucleofecção
Lonza oferece uma forma avançada de electroporação chamada Nucleofection™, que usa soluções de transfecção específicas para células, juntamente com um sistema de fornecimento de pulsos mais nuances que permite a transfecção de muitos tipos diferentes de células, especialmente células humanas primárias normais.
“Em vez de usar soluções tampão de electroporação padrão, usamos soluções de transfecção específicas para células”, diz Gregory Alberts, Ph.D, um especialista global no assunto na Lonza. Isso nos permite estabilizar os poros gerados durante o fornecimento de pulsos”. Especulamos que os poros formados na membrana celular durante a eletroporação padrão se fecham rapidamente”. Nossa tecnologia estabiliza os poros formados pela eletroporação e permite que o material se difunda na célula e, mais especificamente, no núcleo da célula”
A abordagem da Nucleofecção utiliza muitos substratos diferentes: DNA, mRNA, siRNA, peptídeos, proteínas, e pequenas moléculas. As eficiências de transferência para siRNAs e mRNAs são muito boas, melhores que 90%. Pequenos peptídeos geralmente se transferem com cerca de 80% de eficiência, e as eficiências para DNA plasmídeo estão entre 50% e 90%, dependendo do tipo de célula. Mesmo grandes substratos, proteínas maiores, como anticorpos ou cromossomos artificiais bacterianos (BACs), podem entrar nas células alvo com eficiências de transfecção razoavelmente eficazes.
“A nucleofecção é surpreendentemente flexível”, declara o Dr. Alberts. “Tem sido usado para transfectar todos os tipos de células humanas primárias. Tem sido usada na geração de iPSC (células-tronco pluripotentes induzidas), na transfecção de CRISPR e outros substratos edificantes do genoma, assim como na transfecção de alvos mais exóticos como a família Plasmodium de parasitas que causam a malária. Outros organismos similares também podem ser transfectados com Nucleofecção para permitir a investigação de doenças tropicais”
A plataforma de Nucleofecção é escalável. Por exemplo, o sistema de Nucleofecção de alto rendimento pode lidar com os formatos de 96 poços e 384 poços. Muitas vezes este sistema será empregado em uma instalação de triagem de núcleo. Os cientistas na bancada podem usar o Núcleo de 4 NFE de baixo rendimento para otimizar as condições de ensaio. Como a bancada 4D Nucleofector usa as mesmas condições de transfecção, trabalha com os mesmos números de células e oferece o mesmo desempenho que os dispositivos de maior rendimento, quando é hora de subir a uma escala maior, o ensaio não requer uma re-optimização.
“A continuidade do sistema permite a comparação de maçãs com maçãs à medida que o projeto sobe ou desce”, ilustra o Dr. Alberts.
“Estamos no processo de teste beta de um novo dispositivo de transfecção de grande volume que será capaz de transferir 200 milhões a 1 bilhão de células em um formato que varia de 1 a 20 mL. Resultados preliminares mostram que o dispositivo transfere células humanas primárias ou linhas de células nos mesmos níveis que os outros dispositivos de Lonza Nucleofector”, continua o Dr. Alberts. “Este produto será lançado apenas para fins de pesquisa, embora devido à capacidade da Nucleofecção de transferir células humanas primárias tão bem, sem dúvida haverá interesse em usar este dispositivo em aplicações mais orientadas clinicamente”
Dr. Alberts prevê que a Nucleofecção poderia desempenhar um papel nas terapias inovadoras e personalizadas do câncer, tais como a terapia com células T antigênicas quiméricas (CAR-T), bem como outras terapias baseadas em células que requerem a transfecção ou modificação genômica de células humanas primárias.
“A capacidade da Nucleofecção de transfetar fácil e efetivamente células T humanas primárias atrairá a atenção em abordagens de terapia gênica para tratar doenças. A abordagem de Lonza para potenciais aplicações gene-
terapia também tem uma pegada muito pequena. Isto é crucial porque ‘sobras’ de maquinaria de outras técnicas de transfecção podem levar a consequências biológicas não intencionais”, conclui Dr. Alberts.
Cientistas da Lonza avaliaram a capacidade da tecnologia de Nucleofecção da empresa para transfectar células musculares lisas aórticas de ratos adultos dissociadas (AoSMCs). As AoSMCs criopreservadas de ratos foram descongeladas e cultivadas por sete dias em placas de cultura de 24 poços, e as células foram transfectadas em aderência usando a solução AD1 4D-Nucleofector Y. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram fixadas e analisadas. Actin é mostrado em vermelho; GFP, em verde.
Formulações
Mirus Bio desenvolve e fabrica novas formulações de transfecção, que permitem uma alta eficiência e uma baixa toxicidade na entrega de muitos tipos diferentes de moléculas de ácido nucleico. Muitas das formulações são livres de componentes derivados de animais. “Livre de animais” é uma qualidade importante para aplicações pré-clínicas e clínicas.
O sistema CRISPR requer a entrega de um RNA guia (gRNA) e expressão da endonuclease Cas9, que pode ser na forma de proteína, mRNA, ou DNA. A Mirus Bio oferece soluções de transfecção para apoiar a entrega eficaz de todas as diferentes moléculas codificadoras do Cas9. Ao usar métodos de transfecção química para o fornecimento da proteína Cas9, os investigadores podem usar níveis muito mais baixos de proteína se ela for pré-complexada com o gRNA.
“Alguns tipos de células difíceis de serem transferidas produzem maiores eficiências de clivagem com a transfecção da proteína Cas9 complexada dentro do complexo RNP (ribonucleoproteína)”, afirma Laura Juckem, Ph.D., R&D líder do grupo na Mirus Bio. “O Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System fornece efetivamente complexos RNP e permite que menores concentrações de proteína Cas9 sejam utilizadas em comparação com a eletroporação”
Outro desafio enfrentado pelas empresas é a mudança de culturas aderentes para culturas em suspensão para acomodar a grande quantidade de material necessário para os ensaios clínicos. Isto é especialmente verdadeiro para a produção de lentivírus recombinante e vírus adeno-associado (AAV). “Trabalhamos de perto com nossos clientes para garantir que suas transfecções sejam bem sucedidas e que as mudanças em seu fluxo de trabalho ainda produzam produtos de alta qualidade”, explica Dr. Juckem.
“Para terapia baseada em células, o Sistema de Expressão CHO-gro® foi desenvolvido para dar altos rendimentos de proteínas bioterapêuticas em células CHO em suspensão. Este sistema otimizado promove o crescimento celular de alta densidade e permite aos pesquisadores obter proteína suficiente para realizar estudos pré-clínicos e análises de caracterização inicial”, conclui Dr. Juckem.
Esta imagem, de uma apresentação da Mirus Bio descrevendo a transfecção de alta eficiência das células-tronco, indica que células somáticas como as células fibroblásticas adultas podem ser transfectadas ou transduzidas através de vários métodos com uma combinação de fatores de transcrição. Depois de reprogramadas para um estado pluripotente, as células podem ser guiadas para diferentes destinos através da adição de factores de crescimento e/ou transferência de marcadores de selecção impulsionados por promotores específicos do tipo de célula. A imagem enfatiza que reagentes de transfecção podem ser adicionados a um fluxo de trabalho de células-tronco em vários pontos.
Aximações Animais Completas
Thermo Fisher Scientific permanece a par das necessidades do cliente para gerar dados mais relevantes biologicamente usando células primárias, ao invés de linhas de células imortalizadas. Células primárias são tradicionalmente mais difíceis de serem transfectadas com métodos químicos. Entretanto, dados gerados a partir de culturas de células primárias tendem a fornecer respostas que se traduzem melhor em modelos in vivo de animais inteiros.
Modelos de culturas de células tridimensionais, que produzem resultados mais pertinentes do que culturas de células bidimensionais, são mais difíceis de serem transfectadas com métodos tradicionais.
“A transferência de culturas primárias com DNA é um desafio. Usando siRNA (pequeno ácido ribonucleico inibitório), mRNA (RNA mensageiro) e proteína diretamente é mais prontamente aceito pelas células primárias, pois esses compostos só precisam ser entregues ao citoplasma e não ao núcleo celular”, afirma Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D, diretor de R&D da Thermo Fisher Scientific.
“A entrega ao núcleo acontece quando as células se dividem”, continua Dr. de Mollerat “Como as células primárias não se dividem tão prontamente como as linhas celulares, podemos contornar o problema entregando moléculas ao citoplasma e não ao núcleo.”
Continuando a busca por sistemas mais relevantes biologicamente em animais inteiros, “descobrimos que o uso in vivo de Invivofectamina® 3.0 pode efetivamente derrubar a expressão de uma proteína em 90% nas células hepáticas”, articula o Dr. de Mollerat. “Este uso in vivo de Invivofectamina dá aos cientistas um modelo mais eficaz de como são os tratamentos no animal inteiro”
Outra aplicação da tecnologia de transfecção é o desenvolvimento de vacinas. A linha do tempo para o desenvolvimento de vacinas pode ser imensamente abreviada usando mRNAs transfectados para expressar antígenos contra os quais o organismo pode desenvolver uma resposta imunológica. Dado o número de novos vírus encontrados no mundo, como Zika e chikungunya, ter a capacidade de desenvolver vacinas rapidamente irá melhorar muito a saúde mundial.
Com o desenvolvimento contínuo de terapias imunológicas visando os cancros, as células T são frequentemente visadas com receptores específicos. “Temos trabalhado com empresas interessadas em desenvolver essas terapias”, esclarece o Dr. de Mollerat. “Trabalhamos de perto com empresas para abordar as questões de como fabricar estes tratamentos, fazer estes tratamentos em grande escala e torná-los disponíveis em todo o mundo”
Invivofectamina 3.0 é um reagente fornecido pela Thermo Fisher Scientific para a entrega in vivo de RNAi. De acordo com a empresa, uma única injeção resulta em um knockdown significativo no primeiro dia e por até 3 semanas. Esta descoberta surgiu de um estudo no qual o reagente foi injectado na cauda de um roedor em várias doses (1, 0,5, e 0,25 mg/kg). O soro foi coletado nos dias 2, 5, 9, 16, 23 e 30, e o soro foi analisado para pesquisa de colisão com proteína FVII através de um ensaio cromogênico. A empresa observou que maiores quantidades de siRNA nos complexos injetados resultaram em knockdown mais duradouro ao longo da faixa testada.