O cDNA é um encalhamento simples ou duplo ? – (Fev/09/2006 )

Olá,
Pus a minha pergunta noutro lado mas não obtive resposta, gostaria de a colocar aqui e, desculpem, parece uma pergunta estúpida, porque estou mesmo confuso !
Leio em algum lado uma coisa que me deixa perplexo acerca do cDNA. Eu gostaria de saber se cDNA é um encadeamento duplo ou um encadeamento simples ?
Eu sei que cDNA é a cópia do mRNA por transcriptase reversa então, teoricamente, seria um encadeamento simples , certo ou estou enganado ?
Poisas para o seu feedback

Para a maioria dos casos, como para RT-PCR, 3′ ou 5′ RACE, nós usamos apenas cDNA de fio simples (o primeiro fio cDNA), enquanto no caso de preparar o cDNA para a construção de bibliotecas, ou análise RDA/SSH que pode precisar de uma segunda etapa de síntese de fio para gerar cDNA de fio duplo.

hi
você precisa diferenciar 2 coisas :
cDNA em geral é a molécula de DNA que corresponde aproximadamente à suaqência de mRNA. Então é uma molécula duplamente encalhada incluída no plasmídeo para expressão na maioria dos casos.
RT PCR : a molécula de mRNA é transcrita de forma inversa em cDNA simples encalhamento. Depois deste ponto, o RNase elimina a molécula de mRNA e obtém-se uma molécula de cDNA de cadeia única. Como o próximo passo é uma PCR bastante clássica, uma única cadeia é suficiente para a expulsão (e o primeiro passo, que corresponde à sísntese da segunda cadeia de uma molécula de DNA, restaura a verdadeira molécula de cDNA.
Para estar certo, cDNA é uma molécula de cadeia dupla, mas por conveniência, cDNA também é usado para projetar a molécula transcrita reversa do RTPCR. Ela deve ser nomeada como cDNA de meio fio ou cDNA de fio simples.
cDNA é um nome abreviado.

enquanto na maioria dos casos, cDNA, abreviatura de DNA complementar, é definido como uma molécula de DNA de cadeia única com uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma molécula de RNA, e é sintetizada no laboratório a partir do mRNA por transcrição reversa…

Então, o cDNA é encalhado individualmente até que uma reacção de PCR seja realizada ? Ok, neste caso, como a Taq DNA Polimerase gera um segundo cordão complementar a partir de apenas um ? Quando os dois primers se ligam a cada lado do mesmo fio, como podem produzir o segundo fio (o novo complemento) ?

Em PCR um primer liga-se a um único fio de ADN (é por isso que o primeiro passo é sempre a dentadura a 94C(mais ou menos) para separar quaisquer moléculas duplas em fios simples. No caso do cDNA da primeira cadeia a partir de uma reacção RT, apenas um primário se liga na primeira… Isto significa que a primeira rodada de amplificação em uma RT-PCR não é logítmica, você simplesmente sintetiza a segunda cadeia de cDNA. Nas rondas subsequentes (ronda 2 a ronda n) há amplificação logítmica porque tanto os iniciadores para a frente como os iniciadores para trás ligam-se ao modelo desnaturado de duplo encadeamento.
Na primeira ronda, acho que é o primer forward que liga. Eu acho que é porque o mRNA=faixa dianteira no genoma e a primeira cadeia cDNA=complemento do mRNA (ou é o mesmo que a cadeia reversa no genoma)
Algum verifica a minha lógica aqui, eu estou me confundindo… é isso mesmo que o mRNA é o complemento da cadeia reversa do DNA genômico?
ie: mRNA sequence=forward strand=5′-3′ sequence in gDNA (just with U not T)???
HTH

Obrigado a todos, Agora está mais claro para mim.

Acho que sim, até encontrar um intron, certo?
Podemos verificar qualquer uma das suas sequências de mRNA conhecidas no NCBI, recuperar o hit genómico e comparar as sequências para ver se é verdade ou não.

Yup isso mesmo, você teria que pular os introns
Sons como uma boa maneira de testar vão tentar mais tarde se eu tiver uma chance e deixar você saber… quanto mais eu penso sobre isso, a seqüência de mRNA=seqüência de strand para frente tem que estar certa…
Obrigado!