A Introdução Geral
A maioria de nós sabe que as leveduras são um organismo muito útil, especialmente no que diz respeito à panificação, vinificação e fermentação. No entanto, o que são leveduras e porque são o foco de tanta pesquisa?
As leveduras são Fungos
As leveduras são microrganismos unicelulares que são classificados, juntamente com moldes e cogumelos, como membros dos Fungos do Reino. As leveduras são evolutivamente diversas e por isso são classificadas em dois filamentos separados, Ascomycota ou fungos do saco e Basidiomycota ou fungos superiores, que juntos formam o subreino Dikarya. As leveduras de broto, também referidas como “leveduras verdadeiras”, são membros do filo Ascomycota e da ordem Saccharomycetales. Tais classificações são baseadas em características da célula, ascósporo e colónia, bem como na fisiologia celular.
As leveduras são unicelulares, mas com Organização Celular Similar a Organismos Superiores
Embora as leveduras sejam organismos unicelulares, elas possuem uma organização celular semelhante à dos organismos superiores, incluindo os humanos. Especificamente, o seu conteúdo genético está contido dentro de um núcleo. Isto os classifica como organismos eucarióticos, ao contrário de seus pares unicelulares, bactérias, que não possuem núcleo e são consideradas procariotas.
Habitats Naturais
Yeast estão amplamente dispersas na natureza com uma grande variedade de habitats. São comumente encontrados em folhas, flores e frutos de plantas, assim como no solo. As leveduras também são encontradas na superfície da pele e no tracto intestinal dos animais de sangue quente, onde podem viver simbioticamente ou como parasitas. A “infecção por leveduras” comum é tipicamente causada por Candida albicans. Além de ser o agente causador nas infecções vaginais por leveduras, a Candida é também a causa de erupção cutânea e aftosa da boca e garganta.
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Porquê Levedura de Estudo?
Imagine um organismo que cresce rapidamente num frasco e cujo DNA pode ser facilmente manipulado, mas também fornece uma visão dos processos biológicos humanos básicos, incluindo a doença. A levedura encaixa nessa descrição e é o foco de estudo para pesquisadores em todo o mundo, resultando em mais de 50.000 artigos científicos publicados descrevendo pesquisas com leveduras!
Que características específicas da levedura fazem dela um “organismo modelo” para estudo e o foco de tanta pesquisa? As leveduras são organismos unicelulares (unicelulares), tornando-as simples de estudar, mas possuem uma organização celular semelhante à encontrada em organismos mais elevados e multicelulares como os humanos – ou seja, possuem um núcleo e, portanto, são eucariotas, como descrito acima. Mais importante ainda, a semelhança na organização celular entre a levedura e os eucariotas superiores se traduz em semelhanças em seus processos celulares fundamentais, de modo que as descobertas na levedura freqüentemente fornecem pistas diretas ou indiretas sobre como os processos biológicos funcionam nos humanos.
Outra característica importante da levedura essencial ao seu papel como “organismos modelo” é o facto de serem relativamente fáceis de trabalhar. As leveduras replicam-se rapidamente e são fáceis de manipular geneticamente. O tempo de duplicação da levedura (o tempo necessário para uma célula se duplicar e dividir) é de cerca de 90 minutos. Em contraste, as células humanas que crescem em cultura precisam de cerca de 24 horas para duplicar. Existem também métodos genéticos bem definidos para a levedura que permitem aos investigadores isolar facilmente os mutantes, cruzá-los com outros mutantes ou para outras origens genéticas e mapear as localizações dos genes. De fato, os mapas genéticos construídos com base na distância genética entre os genes deram aos pesquisadores sua primeira visão do genoma e sua organização, e foram o culminar de estudos genéticos que datam da primeira metade do século XX.
Um ritmo acelerado de descoberta foi possível após o genoma da levedura de padeiro (S. cerevisiae), representando seu conjunto completo de material genético, ter se tornado o primeiro genoma eucariótico a ser sequenciado em 1996. É menor e mais compacto do que o genoma humano (12 milhões de pares de bases e ~6.000 genes, comparado com 3 bilhões de pares de bases e ~20-25.000 genes codificadores de proteínas). No entanto, comparações dos genomas indicam que ~31% dos genes de leveduras são muito semelhantes aos genes humanos e 20% dos genes de doenças humanas têm contrapartidas em leveduras. Além disso, as células de leveduras podem existir como haplóides (um conjunto de cromossomas) ou diplóides (dois conjuntos de cromossomas). Como os haplóides têm apenas uma cópia de cada gene e a quebra e junção eficiente das cadeias de DNA (recombinação), é muito fácil apagar um gene específico em um haplóide e observar os efeitos na célula, ou o “fenótipo” do mutante de deleção. As células diplóides, por outro lado, tornam possível o estudo de genes essenciais (aqueles necessários para o crescimento e viabilidade), apagando uma cópia do gene e fazendo alterações sutis na outra cópia. Finalmente, com a informação da sequência do genoma, foi construído um extenso conjunto de ferramentas de reagentes moleculares e coleções de todo o genoma, proporcionando aos pesquisadores poderosos meios para estudar problemas biológicos. Se um gene de levedura for conhecido por ser semelhante em sequência de ADN a um gene humano, os estudos em levedura podem fornecer pistas poderosas sobre o papel do(s) gene(s) relacionado(s) em humanos. Assim, a relativa simplicidade do estudo das funções celulares da levedura combinada com a sua relevância para organismos superiores faz dela um “organismo modelo” muito poderoso para estudo.
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Vida da levedura e ciclos celulares
Levedura tipicamente cresce assexuadamente através do abrolhamento. Um pequeno botão que se tornará a célula filha é formado na célula dos pais (mãe), e se amplia com o crescimento contínuo. À medida que a célula filha cresce, a célula mãe duplica e então segrega seu DNA. O núcleo se divide e migra para a célula filha. Uma vez que o botão contém um núcleo e atinge um certo tamanho, ele se separa da célula-mãe. A série de eventos que ocorrem em uma célula e levam à duplicação e divisão são referidos como o ciclo celular. O ciclo celular consiste em quatro fases distintas (G1, S, G2 e M) e é regulado de forma similar ao ciclo celular em eucariotas maiores. Enquanto nutrientes adequados tais como açúcar, nitrogênio e fosfato estiverem presentes, as células de levedura continuarão a se dividir assexualmente.
As células de levedura também podem reproduzir-se sexualmente. As células de levedura existem como um de dois tipos diferentes de acasalamento, uma célula e células alfa. Quando células de tipos opostos de acasalamento são misturadas no laboratório ou entram em contato aleatoriamente na natureza elas podem acasalar (conjugar-se). Antes de unir as células mudam de forma em um processo chamado shmooing. O termo ‘shmoo’ foi cunhado com base na sua semelhança em forma com a de um personagem de desenho animado fictício com o mesmo nome, criado no final dos anos 40 por Al Capp, aparecendo primeiro na sua banda desenhada L’il Abner. Durante a conjugação, as células haplóides shmooing primeiro se fundem e depois seus núcleos se fundem, resultando na formação de uma célula diplóide com duas cópias de cada cromossomo. Uma vez formadas, as células diplóides podem se reproduzir assexualmente através da brotação, semelhante aos haplóides. No entanto, quando as células diplóides estão famintas de nutrientes, elas sofrem esporulação. Durante a esporulação as células diplóides sofrem meiose, uma forma especial de divisão celular que reduz o número de cromossomos de duas cópias para uma cópia. Após a meiose os núcleos haplóides produzidos na meiose são embalados em quatro esporos que contêm paredes celulares modificadas, resultando em estruturas que são muito resistentes ao stress ambiental. Estes esporos podem sobreviver por longos períodos de tempo até que as condições se tornem mais favoráveis, como na presença de nutrientes melhorados, onde eles são capazes de germinar e se reproduzir assexuadamente. Estes diferentes estados, brotação, conjugação e esporulação juntos compõem o ciclo de vida da levedura.
Crescimento e metabolismo de leveduras
Quando as células de leveduras são cultivadas em fontes ricas em carbono, como a glicose, elas preferem crescer por fermentação. Durante a fermentação a glicose é convertida em dióxido de carbono e etanol. Geralmente, a fermentação ocorre na ausência de oxigênio e, portanto, é anaeróbica por natureza. Mesmo na presença de leveduras de oxigênio as células preferem crescer fermentativamente e isto é chamado de Efeito Crabtree após o biólogo que descobriu esta preferência. Esta forma de crescimento é explorada no fabrico de pão, cerveja, vinho e outras bebidas alcoólicas. Embora as células de levedura em brotação prefiram crescer por fermentação, quando os nutrientes são limitados também são capazes de crescer por respiração celular. Durante a respiração as células convertem glicose em dióxido de carbono e água, consumindo oxigênio no processo, e resultando na produção de quantidades muito maiores de energia na forma de ATP.
Descobertas Históricas
Yeast tem sido usado como um microorganismo industrial durante 1000 anos. Os antigos egípcios usavam fermentação de levedura para fermentar o pão fermentado. Há evidências de mós, câmaras de cozedura e desenhos de padarias com 4000 anos de idade. As escavações arqueológicas revelaram evidências na forma de frascos contendo os restos de vinho com 7.000 anos de idade.
Os leveduras foram visualizados pela primeira vez em 1680 por Antoni van Leeuwenhoek usando lentes de alta qualidade. No entanto, ele pensou que estes glóbulos eram partículas amiláceas do grão usado para fazer mosto, o extrato líquido usado na fabricação de cerveja, em vez de fermentar células de levedura. Em 1789, Antoine Lavoisier, um químico francês, contribuiu para o nosso entendimento das reações químicas básicas necessárias para produzir álcool a partir da cana-de-açúcar. Ao estimar a proporção de matérias-primas e produtos de base (etanol e dióxido de carbono) após a adição de pasta de levedura, ele concluiu que duas vias químicas eram utilizadas com dois terços do açúcar reduzido a álcool e um terço para formar dióxido de carbono. No entanto, na altura pensou-se que a levedura estava lá apenas para iniciar a reacção, em vez de ser necessária ao longo de todo o processo.
Em 1815, Joseph-Louis Gay-Lussac, um químico francês, desenvolveu métodos para manter o suco de uva em estado não fermentado e descobriu que a introdução da ‘fermentação’ (que contém levedura) era necessária para converter o mosto não fermentado, demonstrando a importância da levedura para a fermentação alcoólica. Em 1835, Charles Cagniard de la Tour utilizou um microscópio mais potente para mostrar que a levedura era monocelular e multiplicada pela brotação. Na década de 1850, Louis Pasteur descobriu que as bebidas fermentadas resultavam da conversão da glicose em etanol por levedura e definiu a fermentação como “respiração sem ar”. Perto do final dos anos 1800, Eduard Buchner usou extratos livres de células obtidos pela moagem de células de levedura para detectar zimase, a coleção de enzimas que promovem ou catalisam a fermentação e por isso recebeu o Prêmio Nobel em 1907.
Muito do trabalho pioneiro na genética da levedura foi realizado por Øjvind Winge. Ele descobriu que as leveduras alternam entre estados haplóides e diplóides e que as leveduras são heterotálicas, pois são necessárias duas estirpes para converter haplóides em diplóides (conjugação). Ele e seu colega Otto Laustsen desenvolveram técnicas para micromanipular leveduras para que elas pudessem ser investigadas geneticamente. Com esta técnica, conhecida como “análise tetrad”, uma agulha fina e um microscópio são usados para isolar uma estrutura conhecida como ascus, que contém os quatro esporos ou tetrad resultantes da esporulação de uma diploide. Uma vez isolado o ascus, os esporos da tetrade são separados e deixados crescer em colónias para análise genética. Este trabalho pioneiro valeu-lhe o título de “O Pai da Genética da Fermenta”. Alguns destes trabalhos foram esclarecidos por Carl Lindegren, que elucidou o sistema de acasalamento em leveduras de brotação, demonstrando a existência de células Mat a e Mat alfa, concebeu métodos para carregar nossos acasalamentos em massa entre células destes tipos de acasalamento e usou este conhecimento para estudar a genética da utilização do açúcar.
Desde então muitos outros pesquisadores realizaram pesquisas inovadoras usando leveduras de brotação. Alguns desses pesquisadores receberam o Prêmio Nobel por descobertas significativas feitas durante esses estudos, inclusive: Dr. Leland Hartwell (2001) pela descoberta de genes que regulam o ciclo celular (co-vencedor com Paul Nurse e Tim Hunt); Roger Kornberg (2006) por seus estudos sobre o primeiro passo da expressão gênica, o meio pelo qual uma seqüência de DNA de genes é copiada para o RNA do mensageiro (mRNA); Drs. Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak (2009) pela descoberta e elucidação dos genes e meios pelos quais as células protegem as extremidades dos cromossomas ou telómeros de serem degradados; e aos Drs. Randy Schekman, James Rothman e Thomas Südhof (2013) pela pesquisa sobre a maquinaria que regula o tráfego vesicular. Mais recentemente, o Dr. Yoshinori Ohsumi recebeu o prêmio por seu trabalho em autofagia, que começou com estudos em levedura.
Aplicações Comerciais
A levedura é considerada há muito tempo o organismo de eleição para a produção de bebidas alcoólicas, pães, e uma grande variedade de produtos industriais. Isto é baseado na facilidade com que o metabolismo da levedura pode ser manipulado usando técnicas genéticas, a velocidade com que ela pode ser cultivada até o alto rendimento celular (biomassa), a facilidade com que esta biomassa pode ser separada dos produtos e o conhecimento de que ela é geralmente reconhecida como segura (GRAS).
As leveduras de brotação S. cerevisiae e outras espécies de leveduras têm sido usadas há muito tempo para fermentar os açúcares do arroz, trigo, cevada e milho para produzir bebidas alcoólicas, como cerveja e vinho. Existem dois tipos principais de levedura de cerveja, levedura de cerveja de fermentação superior e levedura de cerveja de fermentação inferior. Levedura de fermentação superior, como a S. cerevisiae sobem à superfície durante a fermentação e são utilizadas para a fabricação de cervejas, carregadores, stout e cervejas de trigo. Em contraste, S. pastorianus, (anteriormente conhecida como S. carlsbergensis) é uma levedura de fermentação de fundo usada para fazer cerveja lager. As leveduras de cerveja lager crescem melhor a temperaturas mais baixas. Como resultado, elas crescem mais lentamente, produzem menos espuma superficial e, portanto, tipicamente se instalam no fundo do fermentador. Pilsners, Märzen, Bocks, e licores de malte americanos são todos estilos de cerveja lager. Na fermentação moderna muitas das cepas originais de fermentação superior foram modificadas para se tornarem fermentadores inferiores.
Yeast produzem vinho através da fermentação de açúcares do suco (mosto) de uva em etanol. Embora a fermentação do vinho possa ser iniciada por leveduras naturalmente presentes nas vinhas, muitas adegas optam por adicionar uma cultura de levedura pura para dominar e controlar a fermentação. As bolhas no champanhe e nos vinhos espumantes são produzidas por uma fermentação secundária, tipicamente em garrafa, que aprisiona o dióxido de carbono. O dióxido de carbono produzido na produção de vinho é libertado como um subproduto. Uma célula de levedura pode fermentar aproximadamente o seu próprio peso em glicose por hora. Sob condições ideais, S. cerevisiae pode produzir até 18%, em volume de etanol, sendo 15 – 16% a norma. O dióxido de enxofre presente no vinho produzido comercialmente é adicionado logo após as uvas serem esmagadas para matar as bactérias, bolores e leveduras naturalmente presentes.
Saccharomyces cerevisiae ou levedura de padeiro há muito tempo que é usada como fermento na panificação. A levedura de padeiro fermenta açúcares presentes na massa, produzindo dióxido de carbono e etanol. O dióxido de carbono fica preso em pequenas bolhas na massa, o que faz com que a massa se levante. O pão de massa é uma exceção, pois não é produzido com levedura de padeiro, mas sim com uma combinação de levedura selvagem e bactérias. A levedura Candida milleri é usada para fortalecer o glúten, e uma bactéria geradora de ácido “Lactobacillus sanfranciscensis”, é usada para fermentar a maltose.
Além destes usos tradicionais, a levedura também tem sido usada para muitas outras aplicações comerciais. Os veganos utilizam frequentemente a levedura como substituto do queijo e é frequentemente utilizada como cobertura para produtos como pipocas. Ela está sendo usada na indústria petroquímica, onde foi projetada para produzir biocombustíveis como o etanol e o farneseno, um precursor do diesel e do jet fuel. Também é utilizado na produção de lubrificantes e detergentes. A levedura é utilizada na indústria alimentícia para a produção de aditivos alimentares, incluindo corantes, antioxidantes e intensificadores de sabor. É o mais utilizado na produção de produtos farmacêuticos, incluindo antiparasitários, compostos anticancerígenos, biofarmacêuticos como a insulina, vacinas e nutracêuticos. A levedura é comumente usada na produção de enzimas e produtos químicos industriais. No campo das cepas de biorremediação ambiental foram mesmo exploradas para a remoção de metal dos resíduos da mineração.
Aplicação a doenças humanas e pesquisa
Em virtude do alto grau de similaridade entre os genes da levedura e seus pares humanos, e conservada a biologia celular fundamental, a levedura se tornou um sistema modelo popular para o estudo de genes de doenças humanas. Várias abordagens têm sido usadas para aprender mais sobre genes humanos uma vez que uma ligação entre um gene humano e um gene de levedura é feita. Em uma abordagem, após a descoberta de um gene associado a uma doença humana, a sequência é comparada com as sequências de todos os genes do genoma da levedura para identificar o(s) gene(s) de levedura mais semelhante(s). Para estudar se os genes estão funcionalmente relacionados, o gene humano é então expresso em uma mancha de levedura onde o gene da levedura foi primeiro inativado por mutação. Isto permite aos pesquisadores determinar se o gene humano é ou não capaz de resgatar a viabilidade, crescimento ou defeitos mais específicos associados à perda do gene da levedura, um método referido como complementação funcional. Se os caminhos e/ou processos em que um gene de levedura está envolvido são conservados, muito pode ser aprendido sobre a função do gene humano com base no que já é conhecido sobre o gene de levedura relacionado. Uma vez estabelecida a complementação funcional, os pesquisadores podem usar este sistema para caracterizar ainda mais a função do produto genético humano relacionado. Abordagens menos direcionadas que freqüentemente utilizam técnicas de alto rendimento (HTP) para selecionar aleatoriamente milhares de genes humanos de uma vez para identificar o gene ou genes com atividade complementar. Tais abordagens têm sido usadas com sucesso para identificar reguladores do ciclo celular conservado (CDC2), genes envolvidos em câncer e genes envolvidos em doenças neurodegenerativas.
Existem muitos cenários onde estudos podem fornecer informações valiosas para pesquisadores sobre os caminhos celulares e/ou processos em que um gene humano está envolvido quando um gene de levedura relacionado não está presente. Por exemplo, algumas doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson ocorrem como agregados protéicos chamados amilóides acumulam-se devido ao desdobramento proteico e isto é tóxico para os neurônios. O estudo de proteínas de leveduras desdobradas com potencial de formação de amilóide semelhante, chamadas priões, tem fornecido aos pesquisadores uma visão mais profunda sobre essas doenças neurodegenerativas. Alternativamente, a expressão elevada de um gene associado a uma doença em leveduras pode resultar em um fenótipo. Por exemplo, quando expressa em níveis suficientemente elevados, a alfa-sinucleína, um gene associado com a doença de Parkinson, é tóxica. Tal cepa pode então ser usada para triagem de genes de leveduras ou pequenas moléculas que suprimem ou aumentam a toxicidade induzida pela sinucleína, freqüentemente fornecendo pistas sobre as vias celulares relevantes. Pacientes com Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) ou Doença de Lou Gehrig, freqüentemente têm mutações em um par de proteínas de ligação ao RNA, o que os torna propensos a formar agregados que interferem no metabolismo do RNA. Uma tela de levedura tem sido usada com sucesso para identificar um número de genes de levedura com propriedades similares (formar agregados tóxicos), fornecendo aos pesquisadores novos genes candidatos para estudo. Por outro lado, quando expressas em leveduras, as proteínas de ligação ao RNA humano formam agregados tóxicos e esta cepa foi usada para identificar um gene de levedura que quando mutado bloqueia a produção destes agregados.
A levedura está se tornando o organismo de escolha em estudos que visam a identificação de alvos de drogas e o modo de ação de várias drogas. Quimiogenómica ou químico-genómica refere-se às telas que utilizam uma combinação de substâncias químicas e genómicas para sondar alvos de fármacos e potencialmente identificar novos fármacos. Duas abordagens principais têm sido utilizadas nestes estudos químico-genómicos. Na primeira, uma coleção de linhagens diplóides em todo o genoma é construída onde uma das duas cópias idênticas de um gene é apagada, baixando assim os níveis de um determinado produto genético. Os genes alvo e os genes envolvidos na via alvo tornam-se mais sensíveis ao composto e são preferencialmente identificados neste tipo de tela. Numa segunda abordagem, os genes não essenciais são sistematicamente eliminados e a recolha é rastreada com um fármaco para procurar genes que protejam a via de destino do fármaco. Esta abordagem é esperada para identificar os genes necessários para o crescimento na presença do composto. Abordagens adicionais usando telas de superexpressão têm sido usadas para identificar genes envolvidos na resistência a drogas, incluindo o potencial alvo da droga. A comparação do perfil de expressão das células de levedura eliminadas para um gene com as células de levedura do tipo selvagem tratadas com um determinado medicamento também pode ser uma forma eficaz de identificar genes que podem dizer aos pesquisadores algo sobre como o medicamento funciona nas células.
Estes são apenas alguns exemplos de como a levedura pode ser usada tanto ajudam no estudo da doença humana. Estudos em leveduras podem ajudar os pesquisadores a aprender mais sobre a biologia subjacente usando este sistema modelo, ou para ajudá-los a identificar alvos de medicamentos ou o modo de ação dos medicamentos.
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Recursos
- O Banco de Dados de Genomas Saccharomyces cerevisiae (SGD) fornece informações biológicas integradas e abrangentes para a levedura em crescimento Saccharomyces cerevisiae juntamente com ferramentas de pesquisa e análise para explorar estes dados.
- MIPS Comprehensive Yeast Genome Database (CYPD) apresenta informações sobre a estrutura molecular e a rede funcional do modelo eukaryote inteiramente sequenciado e bem estudado, a levedura de abrolhamento Saccharomyces cerevisiae.
- Candida Genome Database (CGD), um recurso para dados de sequência genómica e informação genética e proteica para Candida albicans.
- PomBase, uma base de dados abrangente para a pomba de levedura de fissão Schizosaccharomyces, fornecendo anotação estrutural e funcional, curadoria de literatura e acesso a conjuntos de dados em larga escala.
- Recursos do genoma fúngico no NCBI, um guia de recursos do genoma fúngico no Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI).
- Uma extensa lista de recursos relacionados com a levedura em tópicos que vão desde informação geral sobre levedura até ácidos nucléicos, genomas e proteínas, dados de expressão, localização, fenótipos e mais.
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Leitura de Fungos
Livros
- Livro de Levedura. (2011) Um abrangente compêndio de revisões que apresenta o estado atual do conhecimento da biologia molecular, biologia celular e genética da levedura Saccharomyces cerevisiae, Genetics
- De a a alfa: A levedura como modelo para a diferenciação celular. (2007) Hiten D. Madhani, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Landmark Papers in Yeast Biology. (2006), editado por Patrick Linder, David Shore, e Michael N. Hall, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Methods in Yeast Genetics: Um Manual do Curso de Laboratório do Cold Spring Harbor. (2005) David C. Amberg, Daniel J. Burke, e Jeffrey N. Strathern. Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- The Early Days of Yeast Genética. (1993) editado por Michael N. Hall e Patrick Linder. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Volume I: The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics. (1991) editado por James R. Broach, John R. Pringle, e Elizabeth W. Jones. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Volume II: The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae: Expressão Genética. (1992) editado por Elizabeth W. Jones, John R. Pringle e James R. Broach. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Volume III: The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae: O Ciclo Celular e a Biologia Celular. (1997) editado por John R. Pringle, James R. Broach e Elizabeth W. Jones. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Levedura: Uma Abordagem Prática. (1988) editado por I. Campbell e , e John H. Duffus, IRL Press, Ithaca, New York.
Journal Articles
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