Pele fóssil revela coevolução com penas e metabolismo em dinossauros com penas e aves precoces

Estrutura do tecido mole fóssil

Pastilhas pequenas de tecido (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d e Figs. Complementares. 2-6) estão intimamente associadas a penas fósseis (i.e, geralmente dentro de 500 µm de resíduos de penas carbonáceas, Suplemento Fig. 2e, g, j, k, o, s, t). As manchas são definitivamente de tecido fóssil e não refletem a contaminação superficial com material moderno durante o preparo da amostra, pois são preservadas em fosfato de cálcio (ver “Tafonomia”, abaixo); além disso, várias amostras mostram margens que são sobrepostas, em parte, pela matriz ao redor. Os tecidos não aderiram, portanto, simplesmente à superfície da amostra como resultado da contaminação por partículas transportadas pelo ar no laboratório.

As manchas de tecido são tipicamente de 3-6 µm de espessura e planas (Fig. 1a-e). Secções transversais e superfícies fracturadas mostram uma camada fibrosa interna (1,0-1,2 µm de espessura) entre duas camadas mais finas sem estrutura (0,2-0,5 µm de espessura) (Fig. 1f-h). A superfície externa da camada sem estrutura é lisa e pode mostrar uma textura poligonal subtil definida por polígonos de 10-15 µm de largura (Fig. 1e, h).

A camada fibrosa também mostra polígonos (Figs. 1f, h e 2a-e, e Suplemento Fig. 6) que contêm matrizes de fibras densamente embaladas 0,1-0,5 µm de largura (Fig. 2f-i e Suplemento Fig. 5f). Fibras bem conservadas mostram torção helicoidal (Fig. 2h, i). As fibras nas partes marginais de cada polígono têm 0,1-0,3 µm de largura e são orientadas paralelamente à superfície do tecido; as do interior de cada polígono têm 0,3-0,5 µm de largura e são geralmente perpendiculares à superfície do tecido (Fig. 2b, h e Suplemento Fig. S6d). Na margem marginal 1-2 µm de cada polígono, as fibras são normalmente ortogonais à margem lateral do polígono e terminam na junção entre os polígonos adjacentes (Fig. 2f, g e Suplemento Fig. 6e). Os polígonos são geralmente equidimensionais, mas são localmente alongados e alinhados mutuamente, onde as fibras espessas em cada polígono são sub-paralelas à superfície do tecido e as fibras finas, paralelas à margem do polígono (Fig. 2j, k e Suplemento Fig. 6g-l). Alguns polígonos apresentam uma depressão central (Fig. 2c-e e Suplemento Fig. 6a-c) na qual as fibras espessas podem envolver uma estrutura globular de 1-2 µm de largura (Fig. 2e).

Corneócitos fósseis

A textura destes tecidos fósseis difere da textura das conchas de conchas e escamas de peixes do sedimento hospedeiro, da concha do Mytilus moderno, do rachis moderno e fóssil de penas e da epiderme moderna de répteis (Suplemento Fig. 7a-n). A geometria alongada de alguns polígonos (Fig. 2j, k e Suplemento Fig. 6g, l) implica uma deformação elástica de um tecido não-biomineralizado devido a tensões mecânicas. Com base no seu tamanho, geometria e estrutura interna, as estruturas poligonais são interpretadas como corneócitos (queratinócitos epidérmicos). Em amniotas modernas, são células poliédricas achatadas (1-3 µm × ca. 15 µm) preenchidas com tonofibrilas de queratina, lipídios e proteínas de matriz18,19,20 (Fig. 3a, b e Figs complementares 2u-x, 8, 9). A camada externa sem estrutura do material fóssil corresponde à margem celular; é mais espessa que o molde biológico original, ou seja, o envelope celular córneo e/ou membrana celular, mas isto não é inesperado, reflectindo o crescimento diagenético excessivo por fosfato de cálcio (ver “Tafonomia”). As fibras nos corneócitos fósseis são identificadas como tonofibrilas mineralizadas: feixes retos, sem ramificações, de fibrilas super-revestidas α-queratina 0,25-1 µm de largura18,21 que são o principal componente do citoesqueleto córneo22 e são envolvidas por proteínas amorfas do citoesqueleto22. Nos fósseis, as finas tonofibrilas muitas vezes se aproximam das células adjacentes (Fig. 2g e Suplementar Fig. 6e), mas localmente podem fazer a ponte entre as células adjacentes (Fig. 2f). Esta última recorda os desmosomas, regiões de forte ligação intercelular entre os córnios modernos23. As estruturas globulares centrais dentro dos corneócitos fósseis assemelham-se a núcleos de células mortas24, como nos corneócitos de aves (mas não de répteis e mamíferos extintos)24 (Fig. 8 do Suplemento). A posição desses núcleos picnóticos é frequentemente indicada por depressões na superfície da córnea em aves existentes24 (Fig. 3b); algumas células fósseis mostram depressões semelhantes (Fig. 2c e Suplemento Fig. 6a-c).

Tafonomia

Queratina é uma biomolécula relativamente recalcitrante devido à sua estrutura paracristalina fortemente reticulada e carácter hidrofóbico não-polar23. A replicação dos corneócitos fósseis em fosfato de cálcio é, portanto, um tanto inesperada, pois este processo geralmente requer gradientes geoquímicos íngremes característicos de decadência precoce25 e geralmente se aplica a tecidos propensos à decadência, tais como músculo26 e tecidos digestivos27. Tecidos recalcitrantes como o colágeno dérmico podem, entretanto, ser replicados no fosfato de cálcio onde contêm uma fonte inerente de cálcio e, em particular, íons fosfato que são liberados durante o decaimento28. Os corneócitos contêm fontes destes dois íons. Durante a diferenciação terminal, as concentrações intracelulares de cálcio aumentam29 e as cadeias de queratina α são extensamente fosforiladas23. Além disso, os grânulos lipídicos de corneócitos30 são ricos em fósforo e fosfato31. Essas moieties químicas seriam liberadas durante a degradação dos grânulos e precipitariam sobre o substrato orgânico remanescente, ou seja, as tonofibrilas.

Em mamíferos existentes, matrizes de tonofibrilas densamente embaladas requerem proteínas de matriz interqueratina abundantes para estabilidade32. Estas proteínas, no entanto, não são evidentes nos fósseis. Isto não é inesperado, pois as proteínas são raras nos corneócitos aviários existentes33 e, criticamente, ocorrem como monômeros dispersos34 e teriam um potencial de preservação menor que os feixes de queratina altamente reticulados e polimerizados das tonofibrilas. A camada externa sem estrutura dos corneócitos fósseis é mais espessa que o(s) provável(is) molde(s) biológico(s), ou seja, o envelope celular córneo (uma camada de lipídios, queratina e outras proteínas até 100 nm de espessura que substitui a membrana celular durante a diferenciação terminal34) e/ou a membrana celular. Isto pode refletir um microambiente local propício à precipitação de fosfato de cálcio: durante a diferenciação terminal, grânulos de queratoalina, uma proteína fosforilada extensivamente35 com alta afinidade por íons cálcio36, acumulam-se na periferia dos corneócitos em desenvolvimento37. A espessura da camada sólida externa de fosfato de cálcio nos fósseis, mais a transição gradual desta para a camada fibrosa interna, sugere que a precipitação de fosfato procedeu das margens em direção ao interior dos corneócitos. Neste cenário, a disponibilidade de fosfato nas zonas marginais das células teria excedido o necessário para replicar as tonofibrilas. O fosfato adicional teria precipitado como fosfato de cálcio nos espaços intersticiais entre as tonofibrilas, progredindo para dentro da face interna da margem celular.

Desprendimento da pele em dinossauros com penas e aves precoces

Em amniotas existentes, a camada cornificada epidérmica tem tipicamente 5-20 células de espessura (mas a espessura varia entre espécies e localização no corpo38). As manchas de corneócitos fósseis, entretanto, são de uma célula de espessura (Fig. 1f e Figs. suplementares 5c, 10). Isto, mais o tamanho pequeno consistente (<400 μm) das manchas e a notável fidelidade de preservação, é inconsistente com a preservação seletiva de uma folha contínua de tecido in situ. Em uma minoria (n = 8) de exemplos, a pele ocorre na borda da amostra de tecidos moles fósseis e assim poderia potencialmente representar um fragmento menor de um pedaço originalmente maior de pele fóssil (com o restante do pedaço na laje fóssil). Na maioria dos exemplos, no entanto, todo o contorno do fragmento de pele está contido dentro da margem de uma amostra. O exame das margens de várias amostras em alta ampliação revela que a amostra e o sedimento circundante estão frequentemente no mesmo plano (por exemplo, Suplemento Fig. 10). Mesmo onde a margem da amostra de pele é coberta por sedimento, é improvável que a amostra tenha sido muito maior do que o tamanho aparente, pois a pele fóssil, sendo quase perfeitamente plana, forma um plano natural de divisão.

Não há evidência de que a espessura preservada da pele seja um artefato de preparação ou erosão. Durante a divisão de uma laje de rocha, o plano de divisão passa frequentemente através dos tecidos moles de forma desigual, expondo estruturas a diferentes profundidades. Nos fósseis aqui estudados, o plano de divisão geralmente passa através dos corneócitos (expondo sua estrutura interna), e raramente ao longo da face externa da camada de corneócitos. Não há evidências de remoção de mais de uma camada de corneócitos: As secções FIB mostram preservação de apenas uma camada e várias imagens SEM mostram secções verticais completas através da pele preservada (onde a relação com o excesso e sedimento subjacente é visível), com evidência para apenas uma única camada de corneócitos. O preenchimento interno fibroso dos corneócitos fósseis é exposto onde o plano de divisão da laje fóssil passa através das manchas de tecido. A topografia dos corneócitos fósseis, contudo, varia com a posição do plano de divisão, que pode variar localmente através dos tecidos moles numa escala milimétrica: os corneócitos podem apresentar-se com margens elevadas e uma depressão central, ou com margens deprimidas e uma zona central elevada (Fig. S9).

O tamanho, geometria irregular e espessura das manchas de corneócitos assemelham-se a flocos de verter da camada cornificada (partículas semelhantes à caspa39; Fig. 3). Nas aves existentes, os corneócitos são vertidos individualmente ou em manchas até 0,5 mm2 que podem ser arrastadas dentro das penas (Fig. 3c, d e Suplementar Fig. 2u, v). Os fósseis aqui descritos fornecem as primeiras evidências para o processo de desprendimento de pele em aves basais e dinossauros maniraptorianos não-aviosos e confirmam que pelo menos alguns dinossauros não-avios derramam sua pele em pequenas manchas40. Este estilo de descamação é idêntico ao das aves modernas18 (Fig. 3c, d) e dos mamíferos20 e implica um crescimento somático contínuo. Isto contrasta com muitos répteis existentes, por exemplo, lepidossauros, que derramam a pele inteira ou em grandes secções21, mas o estilo de derramamento pode ser influenciado por factores tais como dieta e ambiente41.

Impplicações revolucionárias da estrutura de corneócitos fósseis

Os corneócitos fósseis exibem adaptações chave encontradas nas suas contrapartidas nas aves e mamíferos existentes, especialmente a sua geometria poligonal achatada e o conteúdo de células fibrosas consistente com as tonofibrilas de queratina α. Além disso, as tonofibrilas fósseis (como nos exemplos existentes22) apresentam conexões intercelulares robustas e formam um andaime contínuo através da folha de córnea (Fig. 2b, c, j e Suplemento Fig. 6). Em contraste, os corneócitos em répteis existentes contêm uma massa homogênea de β-queratina (com proteínas adicionais presentes no envelope celular) e se fundem durante o desenvolvimento, formando camadas maduras de β-layers sem limites celulares distintos42. A retenção de núcleos picnóticos nos corneócitos fósseis é uma característica claramente aviária não vista nos répteis modernos (mas veja ref. 20).

Morfogênese e diferenciação da epiderme são consideradas como divergentes em terapias e sauropsídeos31. Nossos dados apóiam outras evidências de que características epidérmicas compartilhadas em aves e mamíferos indicam evolução convergente43 e sugerem que conteúdos de corneócitos ricos em lipídios podem ser caracteres derivados evolutivamente em aves e maniraptoranos não-aviosos de penas. Estudos de Evo-devo sugeriram que a epiderme aviária poderia ter surgido a partir da expansão das regiões de dobradiças em ‘protofeather’ – pele escamosa e portadora de penas20. Embora faltem evidências fósseis para essa transição, nossos dados mostram que a epiderme de aves basais e dinossauros maniraptorianos não-aviosos já havia desenvolvido um caráter decididamente moderno, mesmo em taxas não capazes de voar a motor. Isto não exclui a possibilidade de que pelo menos algumas das características epidérmicas aqui descritas tenham tido origem em terópodes mais basais, especialmente onde a pele preservada carece de evidências de escamas (como em Sciurumimus44). Mecanismos genômicos refinados para modulação da expressão complexa da queratina na epiderme45, diferenciação terminal de queratinócitos e a partição da síntese de queratinócitos α- e β- na pele de animais com penas32 foram provavelmente modificados em conjunto com a evolução das penas próximas à base da Maniraptora pelo Jurássico Médio tardio (Fig. 4). Dados fósseis existentes sugerem que isto ocorreu após a evolução do bico em Maniraptoriformes e antes da evolução da patagia do forelimbos e pterilas (Fig. 4); as primeiras ocorrências fósseis de todas estas características abrangem cerca de 10-15 Ma, sugerindo uma explosão de inovação na evolução do tegumento de penas próximo e através do limite do Jurássico Médio-Baixo. A primeira evidência de musculatura dérmica associada a penas é de cerca de 30 Ma mais nova, numa ave ornithothoracean de 125 Ma17. Dado o papel essencial desempenhado por esta rede dérmica no suporte das penas e controle da orientação das penas18, sua ausência em maniraptorianos não-avianos de penas pode refletir um viés taphonômico.

Em certos aspectos, os corneócitos fósseis são distintamente não pertencentes à terra e indicam que os dinossauros de penas e as aves precoces tiveram uma única transição de anatomia e fisiologia integumentária entre a das aves modernas e a dos dinossauros sem penas. Nas aves existentes, as tonofibrilas de corneócitos estão dispersas frouxamente entre os lipídios intracelulares19; isto facilita o resfriamento evaporativo em resposta à produção de calor durante o vôo e o isolamento por plumagem46. Em contraste, as tonofibrilas fósseis são densamente embaladas e enchem o interior da célula. Não há evidências de encolhimento post mortem dos corneócitos fósseis: a faixa de tamanho é consistente com a das aves modernas, e não há evidências de enrugamento diagenético, contorção ou separação de células individuais. Isto sugere fortemente que a densidade preservada de tonofilamentos nos corneócitos fósseis reflete densidades originalmente mais altas do que nas aves existentes. Isto não é uma função do tamanho do corpo: as aves existentes de tamanho díspar (por exemplo, tentilhão-zebra e avestruz) exibem tonofibrilas dispersas de forma solta47. Assim, é provável que as aves fósseis tenham tido uma menor necessidade fisiológica de resfriamento evaporativo e, por sua vez, uma menor produção de calor corporal relacionada com a atividade de vôo46 do que nas aves modernas. Isto é consistente com outras evidências de baixas taxas metabólicas basais em dinossauros maniraptorianos não-avianos47,48 e em aves basais47 e com hipóteses de que as penas de Microraptor49 e, potencialmente, Confuciusornis48 (mas ver ref. 50) não foram adaptadas para voo motorizado, pelo menos por períodos prolongados50,