Proteínas

Lisozima foi a primeira enzima para a qual a estrutura de raios X foi determinada em alta resolução. Isto foi conseguido em 1965 por David Phillips, trabalhando na Royal Institution em Londres. Phillips passou a propor um mecanismo para a ação da lisozima que se baseava principalmente em dados estruturais. O mecanismo Phillips foi desde então confirmado por evidências experimentais, como veremos mais adiante.

Lisozima é encontrada amplamente nas células e secreções (incluindo lágrimas e saliva) dos vertebrados, e a clara do ovo é particularmente rica nesta enzima. A lisozima catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas que ligam o ácido N-acetilmurâmico (NAM) e a N-acetilglucosamina (NAG) nos polissacáridos das paredes das células bacterianas. Ao fazê-lo, danifica a integridade da parede celular, actuando assim como um agente bacteriocida. A ligação NAM-NAG é representada na Figura 40, com o local de clivagem por lisozima indicado.

Figure 40 Part of the polysaccharide component of bacterial cell walls, showing the alternating N-acetilmuramic acid (NAM) and N-acetylglucosamine (NAG) residues. Este polissacarídeo é um substrato para lisozima, que hidrolisa a ligação glicosídica na posição indicada. (Para maior clareza, e para permitir uma representação linear da molécula, algumas das ligações são mostradas em zig-zag.)

Lisozima é uma enzima relativamente pequena. A lisozima de clara de ovo consiste em um único polipeptídeo com 129 aminoácidos de comprimento (Figura 41) com o Sr. 14 600. A partir dos dados da difração de raios X, podemos ver que existe uma fenda distinta na estrutura da lisozima (Figura 42). O local ativo está localizado nesta fenda. Na sequência de aminoácidos da figura 41 e no modelo de preenchimento de espaço da lisozima da figura 42, foram destacados os resíduos que forram a bolsa de ligação do substrato na proteína dobrada.

Figure 41 A sequência de aminoácidos da lisozima de clara de ovo, com os resíduos que forram a bolsa de ligação do substrato destacados a cinzento. Asp 52 e Glu 35, resíduos chave no local ativo, estão destacados em vermelho e amarelo respectivamente.

Figure 42 Um modelo de lisozima de clara de ovo, com os resíduos chave destacados. Asp 52 está em vermelho; Glu 35 está em amarelo; alguns dos resíduos que revestem a bolsa de ligação do substrato são mostrados em cinza.

O local ativo da lisozima é um longo sulco que pode acomodar seis açúcares da cadeia de polissacarídeos de cada vez. Ao ligar o polissacarídeo, a enzima hidrolisa uma das ligações glicosídicas. Se os seis açúcares no trecho de polissacarídeo forem identificados como A-F, o local de clivagem está entre D e E, como indicado na Figura 40. Os dois fragmentos de polissacarídeo são então liberados. A figura 43 mostra os estágios desta reação, que também são descritos em detalhes abaixo.

Figure 43 O mecanismo catalítico da lisozima. Note que apenas os resíduos chave envolvidos na catálise (Glu 35 e Asp 52) são mostrados. Os estágios são descritos em detalhes no texto. (Baseado em Phillips, 1966)

1. Em ligação com a enzima, o substrato adota uma conformação tensa. O resíduo D é distorcido (não mostrado no diagrama) para acomodar um grupo -CH2OH que de outra forma faria um contato desfavorável com a enzima. Desta forma, a enzima força o substrato a adotar uma conformação próxima à do estado de transição.

2. Resíduo 35 da enzima é ácido glutâmico (Glu 35) com um próton que se transfere prontamente para o átomo O polar da ligação glicosídica. Desta forma, a ligação C-O no substrato é clivada (Figura 43a e b).

3. Residue D do polissacarídeo tem agora uma carga líquida positiva; este intermediário de reacção é conhecido como um ião oxónio (Figura 43b). A enzima estabiliza este intermediário de duas maneiras. Primeiro, um resíduo de aspartato próximo (Asp 52), que está na forma de carboxilato carregado negativamente, interage com a carga positiva do íon oxônio. Em segundo lugar, a distorção do resíduo D permite que a carga positiva seja partilhada entre o seu átomo C e O. (Note que esta partilha de carga entre os átomos é denominada ressonância da mesma forma que a partilha de electrões entre os átomos do grupo do peptídeo). Assim, o íon oxônio intermediário é o estado de transição. Normalmente, tal intermediário seria muito instável e reativo. A Asp 52 ajuda a estabilizar o íon oxônio, mas não reage com ele. Isto porque, a 3 Å distância, os grupos reactivos estão muito afastados.

4. A enzima agora liberta o resíduo E com o seu polissacarídeo anexado, produzindo um intermediário glicosil-enzimático. O íon oxônio reage com uma molécula de água do ambiente solvente, extraindo um grupo hidroxila e re-protonando Glu 35 (Figura 43c e d).

5. A enzima então libera o resíduo D com seu polissacarídeo acoplado e a reação é completa.

O mecanismo Phillips para a catálise lisozima, como descrito acima, é apoiado por uma série de observações experimentais. Em particular, a importância de Glu 35 e Asp 52 no processo foi confirmada por experiências de mutagênese direcionada ao local (SDM). SDM é uma técnica muito poderosa para examinar o papel dos resíduos individuais de aminoácidos na função de uma proteína e será discutida com algum detalhe na Secção 7.2. SDM envolve o uso de tecnologia de DNA recombinante para substituir seletivamente o resíduo de interesse por um aminoácido diferente com propriedades criticamente diferentes. A proteína resultante pode então ser testada funcionalmente, por exemplo, em relação à ligação do substrato ou à actividade catalítica. Quando esta técnica foi aplicada à lisozima para substituir o Glu 35 por um resíduo de glutamina (Gln), a proteína resultante ainda podia ligar o substrato (embora menos fortemente), mas não tinha actividade catalítica. Portanto, o Glu 35 é essencial para a atividade catalítica da lisozima. Quando o Asp 52 foi substituído por um resíduo de asparagina (Asn), a proteína mutante tinha menos de 5% da atividade catalítica da lisozima normal (tipo selvagem), apesar de a forma mutante ter na verdade uma afinidade duas vezes maior para o substrato. Segue-se que o Asp 52 é essencial para a atividade catalítica da lisozima. Experimentos com agentes químicos que modificaram covalentemente esses resíduos, sem afetar significativamente a estrutura dos raios X, provaram de forma semelhante que eles eram essenciais para a atividade catalítica.