Relação entre o tamanho do reservatório do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1) em células T do sangue periférico CD4+ e CD4+:CD8+ Células T em indivíduos infectados com HIV-1 Aviremic que recebem terapia anti-retroviral altamente ativa a longo prazo

Abstract

Foi demonstrado que a replicação do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) persiste na maioria dos indivíduos infectados que recebem terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART). No entanto, estudos abordando a relação entre baixos níveis de replicação viral em curso e parâmetros imunológicos, como a relação CD4+:CD8+ células T, em tais indivíduos têm sido inexistentes. Aqui, uma correlação inversa estatisticamente significativa é mostrada entre a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 e a razão de células T CD4+:CD8+ em indivíduos infectados recebendo HAART e nos quais a viremia plasmática tinha sido suprimida abaixo do limite de detecção por períodos prolongados de tempo. Não foi encontrada nenhuma correlação entre a frequência de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos do HIV-1 (CTLs) e a razão de células T CD4+:CD8+ nesses indivíduos. Esses dados sugerem que a replicação viral persistente, de baixo nível e contínua, embora não seja suficiente para manter respostas de CTL específicas para o HIV-1, pode explicar, em parte, porque a normalização da razão de células T CD4+ :CD8+ não é alcançada em alguns indivíduos infectados tratados com sucesso com HAART.

O uso de terapia anti-retroviral altamente activa (HAART) no tratamento de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV- 1) alterou drasticamente o resultado clínico para muitas pessoas infectadas e levou a um declínio substancial na incidência da SIDA e da mortalidade . No entanto, a presença de vírus com capacidade de replicação, DNA proviral HIV-1 (incluindo2 círculos de repetição terminal longa), RNA HIV-1 em células T CD4+ e reservatórios de vírus não identificados foi demonstrada na maioria dos indivíduos infectados em que a viremia plasmática caiu abaixo do limite de detecção, e estas fontes de replicação contínua surgiram como o principal obstáculo na prevenção da erradicação do HIV-1.

Após o início da HAART, a viremia plasmática diminui rapidamente para abaixo do limite de detecção em uma alta proporção de indivíduos infectados e é seguida por um aumento gradual de CD4+ e diminuição da contagem de células T CD8+. Entretanto, a normalização da relação CD4+:CD8+ de células T não é alcançada em alguns indivíduos infectados que responderam com sucesso à HAART . A este respeito, tem sido sugerido que os níveis cronicamente elevados de células T CD8+ ou relações anormais de células T CD4+:CD8+ no sangue periférico são impulsionados pela replicação viral ativa em indivíduos infectados que não são tratados ou que recebem terapia antiviral subótima . Além disso, a expressão do marcador de ativação CD38 em células T CD8+ mostrou ser um marcador prognóstico de progressão da doença . Embora tenha sido sugerido que a falha em normalizar a relação CD4+:CD8+ células T em alguns pacientes que recebem HAART é atribuída à supressão incompleta da replicação viral , não há dados relatados que abordem esta questão diretamente, especialmente em pacientes que têm recebido HAART por períodos prolongados de tempo e nos quais a viremia plasmática tem sido bem suprimida.

Foi estabelecido que o reservatório de células T CD4+ infectadas no sangue periférico, conforme determinado pelo número de células portadoras do DNA proviral HIV-1, é mantido pela replicação viral contínua, mesmo em níveis muito baixos . No presente estudo, avaliamos a relação entre as proporções de contagem de células T CD4+:CD8+ e a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 em células T CD4+ purificadas, bem como a frequência de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos para HIV (CTLs) em indivíduos infectados que receberam HAART por longos períodos de tempo e nos quais a viremia plasmática foi suprimida até abaixo do nível de detecção, conforme determinado por ensaios padrão.

Patientes e Métodos

Isolamento de células T CD4+. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas por centrifugação com gradiente de densidade ficol-hipopaco. As células T CD4+ foram isoladas de PBMC de indivíduos infectados com HIV-1, usando uma técnica de separação de células em coluna (Stem-Cell Technologies), como descrito em outra parte .

PCR quantitativa de DNA HIV-1 em tempo real. Para determinar a frequência de células T CD4+ portadoras do vírus HIV-1 em indivíduos infectados, foi realizada uma PCR em tempo real, conforme descrito abaixo. O DNA genômico foi isolado de 1-2 × 106 células T CD4+ purificadas, usando o kit de isolamento de DNA Puregene (Gentra), de acordo com as especificações do fabricante. O ADN (1 µg) foi então usado como modelo para PCR em tempo real num iCycler (Bio-Rad). A reacção de amplificação foi feita em triplicado usando iniciadores 0,5 µM, sonda fluorescente 0,2 µM, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2, e 2,5 U Platinum Taq Polimerase (Tecnologias de Vida) num volume total de 50 mL. Os primários 5′- GGTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ primer) e 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ primer) foram utilizados juntamente com a sonda fluorescente 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTGTTTTAMRA- 3′. As condições PCR consistiram num passo de desnaturação a 95ºC durante 3 min, seguido de 45 ciclos de 15 s a 95ºC e 1 min a 58ºC. O ADN ACH-2 seriamente diluído foi também submetido à PCR acima referida para obter curvas padrão.

Análise citométrica de células T CD8+ específicas do HIV-1. A frequência das células T CD8+ específicas para HIV-1 foi determinada pela análise de células intracelulares interferão (IFN)-γ-positivas após estimulação com peptídeos específicos para HIV-1 (20 mer sobrepondo-se a 15 aa). Piscinas de peptídeos sobrepostos (1 µg cada; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) abrangendo todas as sequências de gag, pol, env e nef do HIV-1 foram inicialmente incubadas com 3 × 106 PBMC durante 10 min num tubo redondo de 5 ml (Becton Dickinson) em 0.1 mL de meio completo numa incubadora de 37°C de CO2. Em seguida, 0,4 mL de meio completo foi adicionado ao tubo e, após uma incubação de 2 h, Brefeldin A (Sigma) foi adicionado ao meio numa concentração final de 10 mg/mL para inibir a secreção de IFN-γ. Após 6 h de incubação, as células foram lavadas duas vezes, fixadas com solução fixadora 1× (Becton Dickinson) durante 10 min à temperatura ambiente, e lavadas novamente. As células foram permeabilizadas com 1× solução de permeabilização 2 (Becton Dickinson), e foram ainda incubadas à temperatura ambiente durante 10 min. Após serem lavadas novamente, as células foram coradas com os seguintes anticorpos: isotiocianato de fluoresceína conjugado com anti-CD8, anti-IFN-γ conjugado com ficoeritrina, anti-CD69 conjugado com peridinina e anticorpos anti-CD3 conjugado com alofiocianina (Becton Dickinson). Com uma porta em linfócitos CD3+CD8+, foram recolhidos ~100.000 eventos, usando um FACSCalibur (Becton Dickinson), e a frequência de células IFN-γ + CD69+ foi determinada pelo uso do software Cellquest (Becton Dickinson).

Análise estatística. A correlação de classificação de Spearman foi usada como medida de correlação entre (1) a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 e CD4+ e CD8+ contagens de células T e a razão de células T CD4+:CD8+ e (2) a frequência de CTLs e contagens de células T CD4+ e CD8+, a razão de células T CD4+:CD8+ e os números de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1. O teste exato de Fisher foi usado para determinar a associação da proporção de células T CD4+:CD8+ ⩾1.0 ou <1.0 com cargas provirais no compartimento de células T CD4+. O método Bonferroni para o ajuste dos valores de P para testes múltiplos foi aplicado às correlações das contagens de células T CD4+ e CD8+ e relação de células T CD4+:CD8+ com a freqüência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1, e foi aplicado às correlações das contagens de células T CD4+ e CD8+, relação de células T CD4+:CD8+ e os níveis de DNA proviral HIV-1 no compartimento de células T CD4+ com a freqüência de CTLs específicas para HIV-1.

Resultados

Correlação entre o tamanho do reservatório de células T CD4+ do HIV-1 e os parâmetros imunológicos. Para investigar a relação entre o tamanho do reservatório de células T do sangue periférico CD4+ para HIV-1 e parâmetros imunológicos periféricos anormais em indivíduos infectados recebendo HAART por períodos prolongados de tempo, procuramos estabelecer correlações entre a freqüência das células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 e as contagens de células T CD4+ e CD8+ e a relação CD4+ :CD8+ células T. Houve uma correlação inversa estatisticamente significativa entre a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 e a contagem de células T CD4+ no sangue periférico dos indivíduos infectados que estudamos (P = .02; figura 1A). Em contraste, não foi encontrada correlação entre a carga de DNA proviral do HIV-1 nas células T CD4+ e a contagem de células T CD8+ (P = .34; figura 1B). Quando estes 2 parâmetros imunológicos foram combinados e expressos como relação de células T CD4+:CD8+, uma forte correlação inversa foi observada entre estes valores e a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 (P .01; figura 1C). Além disso, 14 (74%) dos 19 pacientes com razão de células T CD4+:CD8+, 1,0 tinham cargas provirais de DNA HIV-1 de <1000 cópias/µg de DNA genômico derivado de células T CD4+. Pelo contrário, 10 (77%) de 13 pacientes com relação de células T CD4+:CD8+ >1.0 tiveram cargas provirais de DNA DNA HIV de ,1000 cópias/mg de DNA genômico derivado de células T CD4+ (P = .01; figura 1C).

Correlação entre a freqüência de CTLs específicas para HIV-1 e parâmetros imunológicos e virológicos. Tem sido demonstrado que a frequência de CTLs específicas do HIV-1 diminui gradualmente após o início da HAART em indivíduos infectados pelo HIV-1, devido à diminuição da disponibilidade de antígenos HIV-1. Foi investigada a relação entre a frequência das LTCs específicas do HIV-1 e a razão de células T CD4+:CD8+ em indivíduos infectados que responderam com sucesso à HAART por períodos prolongados de tempo. Não foi encontrada correlação estatisticamente significativa entre as frequências de CTLs que responderam aos peptídeos específicos do HIV derivados dos genes gag, pol, env e nef e a razão de células T CD4+:CD8+ (figura 2). Além disso, não foi encontrada correlação estatisticamente significativa entre o número de CTLs específicas do HIV-1 e a contagem de células T CD4+ e CD8+ e o número de células T CD4+ portadoras de DNA proviral do HIV-1 (dados não mostrados). De notar que houve uma tendência para números mais elevados de CTLs em indivíduos com menores rácios de células T CD4+:CD8+.

Discussões

O uso generalizado da HAART no tratamento da doença HIV-1 levou a uma melhoria dramática no resultado clínico . Embora a viremia plasmática possa ser mantida abaixo do limite de detecção em muitos indivíduos infectados que recebem HAART, a persistência de baixos níveis de replicação viral contínua nas células T CD4+ tem colocado um grande obstáculo para a erradicação do HIV-1 . De facto, a persistência de baixos níveis de replicação viral são sentidos como o principal factor envolvido na manutenção do reservatório do HIV-1, como reflectido pela frequência de células T CD4+ portadoras de ADN proviral HIV-1 em doentes cuja viremia plasmática foi suprimida pela HAART até abaixo do nível de detecção dos ensaios padrão . Além disso, os níveis sustentados de contagem elevada de células T CD8+ têm sido observados numa elevada proporção de pacientes infectados que recebem HAART . A este respeito, foi sugerido que a replicação viral ativa é responsável pelos níveis elevados de células T CD8+ e que os níveis de expressão do marcador de ativação CD38 nessas células se mostraram um marcador prognóstico de progressão da doença na ausência de terapia antiviral efetiva .

Apesar da falta de dados publicados, especulou-se que as relações CD4+:CD8+ de células T invertidas no sangue periférico de indivíduos infectados que são tratados com sucesso com HAART são devidas a baixos níveis de replicação viral contínua . No presente estudo, examinamos se as taxas de células T CD4+:CD8+ invertidas em alguns indivíduos infectados que recebem HAART por longos períodos de tempo eram devidas à supressão incompleta da replicação do HIV-1, como refletido pelo tamanho do reservatório de DNA proviral do HIV-1 nas células T CD4+. A presença persistente de DNA HIV-1 proviral no compartimento de células T CD4+ em pacientes infectados recebendo HAART tem sido descrita de forma convincente em outros lugares e tem sido considerada como reflexo da inibição incompleta da replicação viral residual em curso, apesar da supressão da viremia plasmática a níveis indetectáveis. Nós demonstramos uma forte correlação inversa entre a frequência de células T CD4+ infectadas contendo DNA proviral HIV-1 e as proporções de células T CD4+ e CD8+, sugerindo que baixos níveis de replicação viral residual podem ter sido parcialmente responsáveis pelas proporções anormais de células T CD4+:CD8+ no sangue periférico.

Embora a frequência de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 possa estar diretamente associada com as proporções de células T CD4+:CD8+, outros fatores podem afetar esta relação. Parâmetros como a existência de reservatórios de vírus desconhecidos que suportam replicação viral ativa na presença de HAART, anormalidades no sistema imunológico do hospedeiro, a potência de determinados regimes terapêuticos, ou outros fatores de confusão podem ter um efeito em ambos os CD4+: CD8+ e as cargas de células T proviralDNA no compartimento de células T CD4+. De notar que os nossos dados sugerem que a replicação viral em curso a níveis que não são detectáveis pelos ensaios padrão para viremia plasmática mas que mantêm o reservatório de células T CD4+ do HIV-1, embora suficiente para impedir a normalização do CD4+: As taxas de células T CD8+ nos pacientes examinados neste estudo, não são suficientes para manter respostas CTL específicas para o HIV-1.

Pode ser argumentado que as taxas anormais de células T CD4+:CD8+ em indivíduos infectados recebendo HAART por períodos prolongados também podem ser atribuídas a fatores imunológicos e virológicos. A este respeito, foi demonstrado que, na ausência de progressão da doença e recuperação suficiente das células T CD4+, a homeostase total de células T é mantida em indivíduos infectados por níveis elevados de células T CD8+ que podem, por sua vez, interferir na regeneração das células T CD4+. Entretanto, não encontramos uma correlação entre os níveis de células T CD4+ portadoras de DNA proviral HIV-1 e a contagem de células T CD8+.

Finalmente, estudos anteriores mostraram que a geração de células T CD4+ no timo é severamente impedida pelas consequências diretas ou indiretas da replicação viral ativa . A este respeito, foram demonstrados níveis diminuídos de produção tímica, medidos pela frequência de células T CD4+ ingénuas portadoras de círculos de excisão receptores de células T, em indivíduos infectados . Embora não esteja claro se os precursores das células T CD4+ estão infectados pelo HIV-1 no timo, nossos dados sugerem fortemente que a supressão incompleta da replicação viral em indivíduos infectados recebendo HAART continua a espalhar a infecção no compartimento de células T CD4+ no sangue periférico, resultando na manutenção do reservatório de células T CD4+ para o HIV-1.

Conhecimento

Agradecemos a Paul Parks pela marcação de visitas aos pacientes, Susan Moir pela leitura deste manuscrito e pelas discussões úteis, e aos pacientes por sua participação neste estudo.

>

>>>

>>>

>>

>>

>>>

>>>

>>

>>>

>>>

>>

>>

>>>

>>>

Figuras e Tabelas