1 Introdução
tRNA dobrável e estabilidade é crucial para uma tradução eficiente, e defeitos em ambas as propriedades podem levar a quantidades reduzidas de tRNA, resultando em defeitos de crescimento em leveduras e doenças em humanos (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, existem duas importantes vias de controle de qualidade celular conhecidas por degradar as espécies defeituosas de tRNAt. O primeiro caminho é a via de vigilância nuclear, que atua sobre o pré-tRNA no núcleo através do uso do exosoma nuclear e do complexo TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) por degradar o pré-tRNAiMet sem a modificação m1A58 ou com um trailer 3′ mal processado (Ozanick et al., 2009) e uma fração de pré-tRNAs do tipo selvagem (WT) (Gudipati et al., 2012). A segunda via é a via de decaimento rápido do tRNA (RTD), que degrada espécies específicas maduras, hipomodificadas ou desestabilizadas de tRNA através da atividade do 5′-3′ exonucleases Rat1 e Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). O RTD é desencadeado em mutantes sem qualquer uma das várias modificações no corpo do tRNA ou através de mutações destabilizadoras, e para todos os substratos de RTD identificados, a eliminação do MET22 restaura totalmente os níveis de tRNA e o crescimento (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Presume-se que a supressão de RTD em met22Δ cepas seja devida à inibição das exonucleases Rat1 e Xrn1 pelo metabolito 3′-phosphoadenosine-5′-phosphate, que tem níveis aumentados quando Met22 é inibido (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).
RTD é conhecido por agir sobre várias espécies específicas de tRNA, que foram identificadas e estudadas usando sete abordagens (Fig. 1). A primeira abordagem foi utilizar microarrays para comparar os níveis de tRNA em trm8Δ trm4Δ mutantes de modificação sensíveis à temperatura (sem m7G46 e m5C) e em cepas relacionadas em condições semipermissivas. Desta forma, identificamos o substrato RTD tRNAVal(AAC), uma vez que ele tinha reduzido os níveis de tRNA no trm8Δ trm4Δ mutante em relação ao WT ou aos mutantes individuais correspondentes (Alexandrov et al., 2006).
Figure 1. Diferentes abordagens usadas para identificar e analisar substratos de RTD.
Na segunda abordagem, foram usadas as “blastos” do norte para examinar tanto a taxa quanto a especificidade da degradação do tRNA para substratos de RTD em mutantes de modificação sensíveis à temperatura. Nessa abordagem, o RNA isolado das células em diferentes pontos de tempo após a mudança de temperatura foi analisado para níveis de tRNAs específicos. A partir dessa análise, verificamos que 50% do RNAVal(AAC) foi degradado em um mutante trm8Δ trm4Δ dentro de 30 min de um turno de 28 a 37 °C, enquanto que o RNAiMet, tRNAMet e tRNAPhe hipomodificado similarmente não mostraram diminuição (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Além disso, os níveis relativos de tRNAVal carregado e não carregado puderam ser medidos pela realização da mancha norte sob condições ácidas, o que mostrou que os níveis de tRNAVal(AAC) carregado foram reduzidos em 50% dentro de 25 min de mudança de temperatura em um mutante trm8Δ trm4Δ e que os níveis de tRNAVal(AAC) não carregado pareceram não afetados (Alexandrov et al, 2006).
A terceira abordagem foi através da supressão do RNAt de alta cópia, onde um plasmídeo de alta cópia expressando um determinado RNAt foi introduzido em um mutante de modificação do RNAt sensível à temperatura. Se o tRNA fosse um substrato de RTD e a sensibilidade à temperatura fosse o resultado da degradação de uma única espécie de tRNA, então a superexpressão do tRNA suprimiria o defeito. Assim, constatamos que a sensibilidade à temperatura de um mutante trm8Δ trm4Δ foi suprimida por um plasmídeo de alta cópia expressando o tRNAVal(AAC), indicando que a sensibilidade à temperatura foi devida principalmente à perda do tRNAVal(AAC), e que as modificações em falta foram importantes para a estabilidade do tRNA (Alexandrov et al., 2006). Da mesma forma, os substratos de RTD de vários outros mutantes de modificação do tRNA foram também identificados usando esta abordagem, incluindo o tRNASer(CGA) e o tRNASer(UGA) em tan1Δ trm44Δ mutantes (sem ac4C12 e Um44) e em trm1Δ trm4Δ mutantes (sem m2,2G26 e m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).
Fourth, utilizamos uma abordagem de substituição genética para identificar determinantes de IDT na família tRNASer substituindo o único gene essencial tRNASer(CGA) (SUP61) por diferentes variantes do tRNASer(CGA) no WT e na cepa met22Δ, e depois testando para crescimento em diferentes temperaturas. Usando esta abordagem, determinamos que as estabilidades combinadas aceitador e haste T foram fortes determinantes da suscetibilidade à IDT na família do gene tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Esta conclusão foi ainda apoiada por uma quinta abordagem para medir a IDT, na qual mostramos in vitro que as variantes do tRNASer(CGA) sem ac4C12 e Um44, ou com mutações desestabilizadoras no tronco do aceitador, eram mais propensas à digestão por Xrn1 e mais suscetíveis à remoção de fosfato pelo 5′ por fosfatase califintestinal (Whipple et al, 2011).
Nesta revisão, discutiremos nossas recém desenvolvidas sexta e sétima abordagens para o estudo de substratos de IDT, que se mostraram extremamente valiosas para ampliar nosso entendimento do caminho da IDT. A sexta abordagem utiliza um repórter fluorescente para analisar de forma abrangente as bibliotecas de milhares de variantes de tRNA nas linhagens WT e met22Δ. Através desta abordagem, identificamos 643 prováveis candidatos a substratos de IDT, muitos em regiões que não se espera que produzam IDT com base em trabalhos anteriores (Guy et al., 2014). Mostraremos dados demonstrando que essa abordagem pode ser usada para estudar a função tRNA sob diferentes condições e discutiremos outras aplicações da abordagem.
A sétima abordagem emprega extensão de primer venenoso para medir os níveis de tRNA em uma cepa WT e met22Δ e é valiosa em sua capacidade de medir especificamente uma variante de tRNA mesmo na presença do tRNA WT cuja seqüência pode diferir por um único resíduo. Nós fornecemos uma metodologia detalhada desta abordagem e discutimos algumas de suas outras possíveis aplicações.