Tumor Xenograft

Caracterização de Bancos de Xenograft

Trabalhar com tumores PDX requer o estabelecimento e manutenção de um banco de tumores, que são implantados em ratos e depois transferidos em série de geração em geração, a menos que esta cadeia de eventos seja interrompida pelo congelamento das amostras. Pensa-se que os PDX reproduzem as características morfológicas do tumor original mais precisamente do que os xenografts de linhas celulares estabelecidas, em termos de perfil histológico e genético. Eles reproduzem a heterogeneidade dos cânceres humanos e têm um melhor valor para prever a resposta ao tratamento.8-16

Lesões inflamatórias são geralmente fáceis de identificar por métodos histológicos. Pelo contrário, para tumores, pode ser mais difícil determinar se o tumor é o esperado ou se tem uma origem diferente. De facto, os tumores murinos podem desenvolver-se no local do xenoenxerto. A maioria destes tumores são linfomas (Fig. 4.2B),11 mas os sarcomas de células fusiformes (Fig. 4.2C) às vezes são observados, e outros tumores murinos, como os tumores de glândula mamária no tecido subcutâneo de ratos fêmeas, também podem ser observados em casos raros. Os tumores espontâneos ou lesões semelhantes a tumores podem também desenvolver-se em órgãos distantes e podem ser mal interpretados como possíveis metástases (por exemplo, adenomas pulmonares; Fig. 4.2D). O simples exame morfológico do tecido geralmente indica claramente se o tumor é do mesmo tipo que o tumor humano original. Isto é particularmente verdade para a maioria dos xenogéneos carcinoma, que têm uma morfologia muito diferente da dos linfomas ou sarcomas. Os carcinomas são geralmente formados por grandes células, claramente dispostas em cordas, túbulos ou lóbulos com um interstício conjuntivo proeminente. Linfomas (sejam humanos ou murinos) consistem em folhas de pequenas células redondas com estroma escasso, e os sarcomas consistem em fluxos de células fusiformes. É, portanto, fácil distinguir estes diferentes tipos de tumores por olho. O diagnóstico pode ser mais difícil se o tumor original for um “tumor azul”, um tumor constituído por pequenas células com muito pouco citoplasma e um núcleo hipercromático, parecendo profundamente basofílico (de cor azul) sob um microscópio com baixa ampliação após coloração com hematoxilina e eosina (H&E). Os tumores blásticos, como o retinoblastoma, são tipicamente tumores azuis. Nestes casos, a morfologia do tumor pode ser difícil de interpretar, particularmente porque as características mais específicas de alguns tumores, como as rosetas de muitos tumores blásticos, são geralmente ausentes ou mal representadas nos ofícios xenográficos. Os tumores anaplásicos, onde as células tumorais têm pouca ou nenhuma semelhança morfológica com as células normais, também podem ser difíceis de caracterizar sem técnicas auxiliares. Como dito, embora seja relativamente fácil diferenciar o sarcoma do linfoma ou carcinoma bem diferenciado, diferenciar o sarcoma xenogênico de lesões inflamatórias ou sarcomas murinos pode ser um desafio, já que estas lesões podem ter morfologia muito semelhante.6

Quando se trata de casos difíceis, ou simplesmente para confirmar que um tumor é realmente de origem humana antes de iniciar um experimento, vários métodos diferentes projetados para revelar proteínas ou seqüências de nucleotídeos específicos da espécie, baseados em imunohistoquímica ou hibridação in situ, podem ser usados para identificar células humanas ou murinas. A caracterização imunohistoquímica das proteínas características de uma linhagem celular é útil para especificar o tecido de origem do tumor.

Deve-se prestar atenção particular ao possível desenvolvimento de linfomas humanos no local de implantação de tumores não linfóides, principalmente durante o implante inicial.11 Tais tumores apresentam os marcadores específicos de células humanas; isto pode levar a confusão com um verdadeiro xenoenxerto se não for realizado um exame morfológico da lesão. Nos estudos PDX, a maioria dos linfomas humanos observados parece desenvolver-se a partir de linfócitos presentes na amostra de tecido utilizada para o enxerto inicial. Se estas células estiverem infectadas com o vírus Epstein-Barr (EBV), os linfócitos B podem sofrer transformação para se tornarem células tumorais.17,18 Estas células são eliminadas eficientemente pelo sistema imunológico em humanos imunocompetentes, enquanto seu enxerto em camundongos imunocomprometidos permite que as células B malignas se desenvolvam e tomem o lugar do tumor humano inicial.11 Alguns casos de linfomas periféricos de células T humanas negativas para EBV também foram descritos no contexto PDX.19 Se o tumor humano original era claramente diferente do linfoma (por exemplo, um adenocarcinoma), então o desenvolvimento de um linfoma humano é fácil de manejar, já que um simples exame morfológico é suficiente para mostrar que o tumor que cresce no local de enxerto não é do tipo esperado e, portanto, deve ser descartado. Se o tumor original era um “tumor azul”, então a demonstração de que o tumor encontrado no local de enxerto é de origem humana pode levar a interpretações errôneas na ausência de caracterização posterior, pois este tumor pode ser na verdade um linfoma humano resultante da transformação maligna dos linfócitos infectados com EBV presentes no tumor inicial, como discutido anteriormente.

Quando um xenoenxerto é estabelecido (os tumores PDX são geralmente considerados estabilizados após três a cinco passagens20), ele deve ser caracterizado, tanto em termos de seu tipo histológico quanto de sua diferenciação. O tipo histológico do tumor é geralmente bem preservado no xenoenxerto, de modo que carcinomas epidermóides e adenocarcinomas tubulares, por exemplo, têm as mesmas características quando formam o PDX.21 Acredita-se que esta estabilidade fenotípica esteja ligada à estabilidade bioquímica, pois alterações bioquímicas marcantes dificilmente resultariam na preservação das características morfológicas.6 A primeira questão que o patologista deve abordar, portanto, é se o tumor presente reproduz as características morfológicas e bioquímicas dos tecidos de origem.17 Caso contrário, pode corresponder a um tumor murino, ou pode ter havido uma grande mudança no padrão de diferenciação do tumor, o que exigiria mais investigação.8

No entanto, em alguns transplantes de primeira geração e cada vez mais após novas passagens, alguns tumores podem tender a se tornar menos diferenciados, com menos ductos ou acini em adenocarcinomas, e maiores taxas de mitose, pleomorfismo nuclear e atipia.20

Detalhes morfológicos específicos podem mudar durante as passagens em série, com aquisição de secreção de mucina ou de diferenciação neuroendócrina, por exemplo, ambos critérios de progressão tumoral em alguns carcinomas (por exemplo, cânceres de próstata).22 Da mesma forma, o padrão de diferenciação tumoral pode ser alterado por modificações nas condições de enxerto, com mudanças no status hormonal do hospedeiro devido à castração ou suplementação hormonal, por exemplo.22

Determinar se a morfologia do tumor é preservada após a enxertia, passagens em série ou experimentos são uma das dificuldades enfrentadas pelos patologistas. De fato, xenogêneros independentes de um mesmo tumor nunca são estritamente idênticos, devido à variabilidade biológica e à heterogeneidade intratumoral. Mesmo secções diferentes de um mesmo tumor e regiões diferentes de uma mesma secção podem apresentar diferenças morfológicas. As características morfológicas das células e seus núcleos, sua disposição espacial, o índice mitótico e a presença de mitoses atípicas, o número de corpos apoptóticos e freqüência de necrose, a abundância de estroma e a vasculatura diferem entre as seções e entre os campos. O patologista deve, portanto, determinar se o padrão global do tumor é preservado e, mais importante, se a histologia do tumor xenografado coincide com a do tumor doador original. As classificações internacionais de tumores humanos devem ser utilizadas como base para uma classificação patológica precisa do xenoganato, mas é necessário algum grau de flexibilidade, pois o xenoganato nunca reproduz perfeitamente a morfologia do tumor humano original.

Quando o xenoenxerto é seguido em passagens sucessivas ou durante experimentos, alterações qualitativas, como a mudança de um padrão trabecular para um tubular, se reproduzível, podem ser consideradas significativas, enquanto que alterações quantitativas, como alterações no índice mitótico ou na quantidade de necrose, particularmente se sutil, devem ser interpretadas com grande cautela.

Uma outra dificuldade nas análises histológicas dos xenobancos tumorais resulta da natureza parcialmente subjetiva da análise morfológica. Se os observadores conhecem bem a morfologia de um determinado tipo de tumor, então sua percepção é finamente ajustada para detectar pequenos detalhes que podem se tornar mais aparentes com o tempo. A seleção de uma amostra de PDX estabilizado para ser usada como referência, para comparação com novas amostras, é aconselhável, para garantir que as lâminas sejam lidas da forma mais objetiva possível. Um banco digital de slides virtuais pode facilitar muito esta tarefa. Se nenhuma diferença óbvia entre a lâmina de teste e a referência puder ser detectada, então a lesão pode ser considerada “similar”; isto não significa que elas sejam idênticas, apenas que nenhuma alteração morfológica significativa pode ser detectada.

Para a primeira amostra observada em um experimento de xenograft, a referência deve ser uma amostra do tumor humano original, ou pelo menos ter uma descrição morfológica como o tumor em questão no relatório de patologia do paciente. Se tal referência não estiver disponível, o patologista pode simplesmente dizer que o tumor é “morfologicamente compatível” com um xenoenxerto de um tumor humano de uma determinada categoria.