Detectarea și identificarea în laborator a speciilor de Aspergillus prin observare microscopică și cultură: abordarea tradițională

Abstract

Testele moleculare și imunologice promit un diagnostic de laborator mai bun și mai rapid al aspergilozei, dar microscopia și cultura rămân instrumente esențiale și frecvent utilizate. Modificările procedurale, precum și formarea adecvată a profesioniștilor de laborator, pot spori valoarea acestor instrumente tradiționale. Utilizarea Blankophor sau Calcofluor pentru examinările microscopice; îmbunătățirea recunoașterii caracteristicilor morfologice ale ciupercilor oportuniste în frotiurile colorate ale specimenelor; maximizarea ratei de creștere și a producției de conidii de către Aspergillus spp. în cultură; și recunoașterea variantelor atipice ale aspergiliilor obișnuite pot îmbunătăți contribuția laboratorului la diagnosticarea rapidă. Sondajele indică faptul că numărul de profesioniști de laborator este în scădere, în timp ce cererea de asistență medicală este în creștere. Recrutarea, menținerea și formarea eficientă a personalului trebuie să fie concomitentă cu progresele tehnologice.

Introducere

Metodele tradiționale de diagnosticare a aspergilozei și a altor micoze sunt completate de abordări moleculare și imunologice. Deși avantajele testelor bazate pe acizi nucleici sunt evidente, standardizarea și utilitatea clinică a acestora nu au fost pe deplin realizate . Mai mult, în timp ce testul EIA cu galactomanan pentru antigenul Aspergillus este disponibil pe scară largă în SUA, utilizarea standard a testelor bazate pe acizi nucleici pentru identificarea izolatelor clinice pare limitată. Printre laboratoarele de referință care oferă servicii de identificare moleculară a aspergilliilor se numără Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Țările de Jos, precum și laboratoarele din SUA enumerate în directorul de teste online al Association for Molecular Pathology. Deși metodele moleculare continuă să se îmbunătățească și să devină mai ușor disponibile, microscopia și cultura rămân principalele instrumente de laborator pentru detectarea aspergilli. Studiul de evaluare comparativă al Societății Americane de Microbiologie (ASM) din 2003 a documentat faptul că 89% dintre laboratoarele care efectuează teste micologice folosesc cultura, 16% folosesc serologia și mai puțin de 5% folosesc teste moleculare. Doar 3% dintre laboratoarele raportoare utilizează teste moleculare „artizanale” pentru agenții patogeni microbieni. Având în vedere dependența continuă de microscopie și cultură, valoarea diagnostică a acestor metode trebuie îmbunătățită prin modificări procedurale și prin formarea adecvată a personalului de laborator.

Microscopie

Metodele microscopice, cum ar fi montările umede, colorațiile Gram și histopatologia convențională, oferă indicii care sugerează prezența Aspergillus spp. în țesuturi. Blankophor sau Calcofluor amestecat cu 10%-20% hidroxid de potasiu (KOH), colorează pereții celulelor fungice și îmbunătățește detectarea ciupercilor. În timp ce Calcofluorul cristalizează într-un pH alcalin, Blankophorul nu și poate fi păstrat într-o soluție de lucru timp de până la un an . Markerii fenotipici detectați prin colorații histopatologice, precum și prin colorații Gram sau montări umede, oferă informații valoroase pentru ciupercile importante din punct de vedere clinic, în special în absența culturii (tabelul 1). Cu toate acestea, confirmarea constatărilor microscopice prin cultură este întotdeauna de dorit și, în majoritatea cazurilor care implică mucegaiuri oportuniste, este esențială pentru identificarea definitivă a agentului patogen. În ciuda prezenței unor indicii vizuale, identificarea aspergiliilor doar prin microscopie poate fi înșelătoare. Schell raportează un caz de sinuzită cu Aspergillus niger în care conidiile de A. niger au fost confundate cu celulele de drojdie de Candida spp. și secțiunile transversale ale stipelor de A. niger au fost confundate cu hifele largi ale unui zigomicete. Comunicarea dintre patologul clinic și micologul de laborator, care identifică în mod obișnuit ciupercile filamentoase din cultură, poate îmbunătăți valoarea diagnostică a histopatologiei.

Recunoașterea caracteristicilor morfologice

Din moment ce aspergilli sunt omniprezenți în natură, aceștia pot contamina în mod obișnuit probele și mediile de cultură. În consecință, determinarea semnificației Aspergillus spp. care cresc în cultură este adesea o provocare atunci când examinarea microscopică a specimenului este negativă. Într-un studiu al izolatelor de Aspergillus de la beneficiarii de transplant de ficat și rinichi, Brown et al. au constatat că prezența a mai mult de două colonii într-o cultură și infecția în mai mult de un loc prezicea o infecție semnificativă. La pacienții granulocitopenici cu leucemie acută, o singură izolare dintr-un specimen respirator inferior trebuie să fie considerată semnificativă . Rapoartele lipsite de ambiguitate ale observațiilor de laborator către medic pot reduce dilema de diagnostic. De exemplu, afirmația: „Un total de trei colonii de Aspergillus fumigatus izolate pe două din trei plăci” oferă mai multe informații decât „Rare A. fumigatus izolate”.

Optimizarea rezultatelor culturii

Isolarea în cultură și identificarea fenotipică a izolatelor clinice comune de Aspergillus spp. este de obicei rapidă și ușoară. Cu toate acestea, cultura este adesea descrisă ca fiind lentă, ceea ce poate crea concepții greșite cu privire la valoarea sa pentru detectarea aspergilliilor. A. fumigatus se dezvoltă rapid. Coloniile tipice velutinice, gri-albastru-verzui și capetele conidiale uniseriate se dezvoltă în 24-48 de ore atât pe medii fungice, cât și pe agarul cu sânge de oaie utilizat în mod obișnuit pentru cultura bacteriană. Alți aspergili asociați cu aspergiloza invazivă, în special A. flavus, A. niger, A. nidulans și A. terreus, au rate de creștere similare cu cele ale lui A. fumigatus atunci când coloniile au fost măsurate pe agar extract de malț și agar drojdie Czapek după incubare timp de șapte zile atât la 25°C, cât și la 37°C . Deoarece rezistența la medicamente a unor Aspergillus spp. reprezintă o amenințare, este necesară o identificare completă, nu numai a lui A. fumigatus, ci și a speciilor izolate mai rar. Cercetătorii de laborator trebuie, de asemenea, să recunoască izolatele atipice de Aspergillus spp. Au fost raportate recent tulpini slab sporulante (albe) de A. fumigatus cu sensibilitate scăzută la mai multe medicamente antifungice . Aceste tulpini albe au o secvență genetică diferită de cea a tipului sălbatic, A. fumigatus Fresenius, și nu au reușit să dezvolte capetele conidiale verzi-albastre tipice decât după 10-12 zile de la incubare. O altă provocare este reprezentată de mucegaiul alb, Neosartorya fisheri, care produce inițial capete conidiale rare, asemănătoare cu cele ale lui A. fumigatus. Cu toate acestea, N. fisheri dezvoltă ulterior numeroase cleistotecii rotunde, cu pereți subțiri, ceea ce face ca diferențierea de A. fumigatus să fie simplă. O lunetă de disecție este utilă pentru localizarea rapidă a capetelor conidiale și a cleistotecilor. Se pot întâlni izolate de A. fumigatus sterile, albe, cu creștere rapidă sau glabre, cu creștere lentă, care necesită testarea termotoleranței și a exoantigenului pentru o identificare definitivă. Khan et al. au raportat un izolat atipic de A. terreus izolat din probele din căile respiratorii inferioare ale unui pacient cu aspergilom. Coloniile inițiale au fost portocalii și au produs un pigment galben difuzibil și celule mici, unice, care au fost confundate cu conidiile de Scedosporium apiospermum. Anticorpii precipitanți și capetele conidiale tipice de A. terreus produse după 10 săptămâni de incubare au confirmat identificarea.

Imaginile și informațiile disponibile în manualele școlare și pe internet oferă oportunități educaționale frumoase pentru a învăța să identifice Aspergillus spp. Experiența practică rămâne, totuși, cel mai eficient instrument de predare. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) și CBS oferă ateliere de laborator. Atunci când deplasarea în afara sediului nu este practică, laboratoarele sunt încurajate să utilizeze tutorialul online, Aspergillus Reference Cultures , pentru formare internă. Organismele de referință enumerate acolo sunt disponibile pentru achiziționare de la principalele colecții de culturi.

Analiza fiecărei etape din procedura de cultură poate duce la o mai bună recuperare a aspergilliilor. Lichefierea specimenelor cu Sputolysin sau alți agenți mucolitici a fost sugerată pentru recuperarea ciupercilor prinse în mucusul sputei și a materialului sinusal recuperat în urma unei intervenții chirurgicale endoscopice . Utilizarea de dextrozei de cartof, a fulgilor de cartof, a extractului de malț, a agarului inhibitor de mucegai sau a unor agaruri de sporulare similare ca medii de izolare primară pentru Aspergillus spp. poate accelera rata de creștere și producția de conidii. Adăugarea de agenți antibacterieni în mediile de izolare contribuie la reducerea timpului de identificare prin inhibarea creșterii excesive a bacteriilor și reducerea necesității de subcultură. Incubarea inițială a mediilor fungice la 35-37°C în loc de 30°C sau în plus față de 30°C poate accelera creșterea unor aspergilli . În mod similar, inspecția zilnică a mediilor de cultură asigură o detectare cât mai timpurie. Prin incubarea plăcilor de cultură într-un mediu microaerofil la 35 °C, Tarrand a constatat că anumite specii de Aspergillus spp. importante din punct de vedere clinic au crescut în 12 din 12 culturi în bulion. Culturile acelorași organisme incubate la 25 °C fără CO2 nu au dat rezultate pozitive. Studii suplimentare ar fi utile pentru a clarifica mediile și condițiile cele mai eficiente pentru recuperarea și identificarea rapidă a aspergiliilor importante din punct de vedere clinic.

Cu un montaj rapid cu scotch-tape sau tease, capetele conidiale de Aspergillus spp. pot fi în mod obișnuit identificate. Cu toate acestea, poate fi necesară o cultură pe lame atunci când sporularea este lentă sau atipică. Ritmul rapid al majorității laboratoarelor din spitale dictează cea mai ușoară, deși nu neapărat cea mai rafinată, metodă de realizare a culturii pe lame. Metoda clasică a lui Riddell de cultivare a lamelelor a fost completată cu alte tehnici, mai puțin laborioase. O metodă rapidă constă pur și simplu în împingerea unui capac de 18 × 18 mm la un unghi de 45 de grade într-un mediu de sporulație, cum ar fi agarul cu fulgi de cartofi. În momentul în care mucegaiul sporulează, lamela se scoate cu grijă din agar și se montează pe o lamelă de microscop într-o picătură de albastru de lacto-fenol sau lacto-fuchsină. O altă picătură este plasată deasupra micului capac înainte de a completa montajul cu un capac de 22 × 22 mm.

Probleme legate de forța de muncă

Diagnosticarea rapidă a aspergilozei depinde nu numai de o metodologie îmbunătățită, ci și de o forță de muncă adecvată și bine pregătită. Sondajele privind practicile de micologie recomandă cu tărie mai multă pregătire . Ar trebui să se pună un accent deosebit pe identificarea precisă, examinarea directă, utilizarea adecvată a mediilor, relevanța clinică și rentabilitatea. Cu toate acestea, un personal inadecvat poate compromite atât formarea, cât și punerea în aplicare a unor proceduri mai relevante din punct de vedere clinic. Sondajul ASM Benchmarking Survey a relevat un deficit continuu de forță de muncă pentru unele laboratoare de microbiologie din SUA. În parte, deficitul este rezultatul unei reduceri de 53%-56% a programelor de formare CLS în ultimii 12 ani. Treizeci și patru la sută dintre profesioniștii care lucrează astăzi în laboratoarele de microbiologie au mai mult de 50 de ani. Vor fi disponibili lucrători mai tineri pentru a-i înlocui atunci când aceștia se vor pensiona? În timp ce aproape 80% dintre femeile din forța de muncă sunt mai tinere de 30 de ani, doar 10% dintre lucrătorii de sex feminin din laboratoarele de microbiologie au mai puțin de 30 de ani . Aceste date sugerează că deficitul de forță de muncă va continua și, posibil, se va agrava.

Concluzie

Îmbunătățirea procedurilor tradiționale și netradiționale de diagnosticare a micozelor necesită eforturi concomitente pentru a asigura o forță de muncă adecvată și pentru a îmbunătăți mobilitatea în carieră, recunoașterea profesională, oportunitățile de formare avansată, remunerarea și alți factori necesari pentru a stimula interesul pentru știința de laborator.