Formarea complexului D
Formarea protrombinazei definește un eveniment modulator important din punct de vedere catalitic, deoarece complexul complet este de 300.000 de ori mai eficient decât factorul Xa liber care acționează asupra protrombinei în soluție.24,72 O implicație a acestei creșteri semnificative a vitezei este că orice disociere a componentelor din complex scade semnificativ și drastic activitatea enzimatică. Absența suprafeței membranare din catalizatorul complet duce la o pierdere de 1000 de ori a eficienței catalitice, în timp ce ștergerea factorului Va din complex duce la o scădere de 10.000 de ori a ratei de generare a trombinei.24 Suprafața membranară este obligatoriu necesară deoarece, deși contribuie puțin la rata intrinsecă a catalizei, oferă un mediu în care atât complexul factor Va-factor Xa cât și substratul se pot coconcentra.277 Se pare că protrombina se concentrează la suprafața membranară plachetară în mare parte prin mecanismele mediate de receptori detaliate anterior. Factorul Va, în virtutea capacității sale de legare la membrană, formează o interacțiune obligatorie și de mare afinitate cu factorul Xa, deoarece factorul Xa nu se va lega la plachetele activate în absența factorului Va. Concentrarea reactanților la suprafața membranară are ca rezultat concentrații locale ridicate de reactivi care depășesc Km intrinsec al reacției și îmbunătățesc semnificativ eficiența catalitică. În plus, factorul Va mărește rata de rotație a reacției printr-un mecanism care nu a fost încă raționalizat.278
Formarea complexelor oferă, de asemenea, constituenților protrombinazei protecție împotriva inhibitorilor și/sau inactivatorilor. Spre deosebire de factorul Xa liber în soluție, factorul Xa încorporat în protrombinază (adică, complexat cu factorul Va legat de membrană) este protejat de inhibiția antitrombinei III și a heparinei.72 De asemenea, factorul Va încorporat în protrombinază este protejat de inactivarea proteolitică de către proteina C109,110 activată – un proces care este discutat în detaliu în secțiunea următoare.
Xaza intrinsecă este modulată de o varietate de mecanisme similare celor observate cu protrombinaza. Formarea complexelor duce la o creștere de aproximativ 2 × 107 ori a eficienței catalitice.217 Legarea factorilor VIIIa și IXaβ la trombina activată de trombină scade Km pentru activarea factorului X de 2500 de ori și permite factorului VIIIa să crească kcat de aproximativ 7500 de ori. Antitrombina III nu poate inhiba factorul IXaβ în prezența factorului VIIIa și a trombocitelor. 279 La fel ca în cazul factorului Va, formarea complexului factorului VIIIa cu factorul IXaβ modulează activitatea acestuia. Disocierea subunității A2 din heterotrimerul factorului VIIIa, care duce la pierderea completă a activității cofactorului, este împiedicată de asocierea sa cu factorul IXaβ pe o suprafață membranară,280 la fel ca și inactivarea sa de către APC.62,281
Pentru că factorul Va este absolut necesar pentru formarea trombinei relevante din punct de vedere fiziologic, variații semnificative în activarea protrombinei pot fi realizate prin modificări proteolitice, de inactivare a cofactorului catalizate de proteina C activată. Proteoliza și inactivarea necesită ca factorul Va să fie legat de plachete59,74 sau de membrană.282 Studiile timpurii au indicat faptul că incubarea proteinei C activate cu plachete activate de trombină a produs o scădere paralelă a legării factorului Xa și a activării protrombinei, sugerând că după clivarea de către proteina C activată, factorul Va nu se leagă de factorul Xa.283,284 Prin urmare, inactivarea catalizată de proteina C activată a factorului Va are un efect dramatic asupra generării trombinei.
Plachetele umane sunt capabile să promoveze și să moduleze inactivarea catalizată de proteina C activată a factorului Va derivat din plasmă și din trombocite, deși aceste două rezerve de cofactor nu sunt substraturi echivalente în ceea ce privește inactivarea. Trei clivaje în lanțul greu al moleculei de factor Va uman sunt necesare pentru o inactivare eficientă catalizată de proteina C activată: clivajul la Arg506, urmat de clivajele la Arg306 și Arg679,282,285 Clivajul la Arg506 este mai rapid și precede clivajul de inactivare, dependent de membrană, la Arg306,282 Suprafața plachetară umană activată cu trombină joacă un rol important în inactivarea catalizată de proteina C activată a factorului Va derivat din trombocite și a variantei factorului Va, factorul VaLeiden.109,110 Factorul VaLeiden este derivat prin activarea cu trombină a factorului VLeiden, o variantă în care Arg506 a fost înlocuit cu glutamină, eliminând în esență situsul de clivaj al proteinei C activate de la poziția 506.286 Astfel, indivizii homozigoți (și, în unele cazuri, heterozigoți) pentru această mutație suferă de un răspuns anticoagulant slab la proteina C activată și prezintă un risc crescut de tromboză venoasă.287-289 Cofactorii plachetarieni normali și mutanți sunt inactivați de proteina C activată la rate aproape identice; cu toate acestea, inactivarea completă a ambilor cofactori derivați din trombocite nu este niciodată realizată,109,110 deoarece rămâne până la 50% din activitatea inițială. Aceste rezultate sunt în contrast pronunțat cu ceea ce s-a observat în studiile privind inactivarea catalizată de proteina C activată a factorului Va și a factorului VaLeiden derivat din plasmă pe vezicule fosfolipidice sintetice.290-292 În aceste studii, se observă întotdeauna inactivarea completă a cofactorilor, deși factorul VaLeiden din plasmă este inactivat la o rată substanțial mai lentă decât factorul Va din plasmă normală. În studiile asupra trombocitelor, rămâne o activitate reziduală mai mare atât a factorului Va Va derivat din trombocite, cât și a factorului VaLeiden, atunci când se utilizează trombocite activate cu trombină ca suprafață membranară de inactivare, în contrast cu inactivarea aproape completă atunci când se utilizează vezicule fosfolipidice sintetice ca suprafață de inactivare.110 Astfel, trombocitele activate protejează cofactorii derivați din trombocite de inactivarea catalizată de proteina C activată.109,110
Plachetele activate protejează, de asemenea, factorul Va normal derivat din plasmă de inactivarea de către proteina C activată prin încetinirea scindării la Arg506.110 Totuși, spre deosebire de cofactorul derivat din trombocite, factorul Va derivat din plasmă poate fi complet inactivat de proteina C activată, sugerând că cele două fonduri diferite de cofactor (plasmă vs. trombocite) sunt substraturi diferite pentru APC.110 Aceste studii confirmă din nou importanța evenimentelor de legare în modularea activității protrombinazei. Ele demonstrează, de asemenea, că membranele plachetare și membranele fosfolipidice sintetice nu sunt suprafețe echivalente în reglarea formării complexelor enzimatice. În mod colectiv, aceste studii indică faptul că trombocitele susțin evenimentele procoagulante prin furnizarea unei suprafețe de membrană care întârzie inactivarea cofactorilor și prin eliberarea unei molecule de cofactor care prezintă un fenotip rezistent la proteina C activată.
Este interesant de luat în considerare faptul că, la locurile de leziune arterială, mutația factorului VLeiden poate să nu prezică atât de ușor tromboza arterială, deoarece cofactorii normali și cei derivați de varianta plachetară sunt la fel de rezistenți la proteina C activată la suprafața plachetară activată. De fapt, rolul demonstrat al mutației factorului VLeiden în prezicerea trombozei venoase287-289 poate reflecta rezistența documentată a cofactorului VaLeiden derivat din plasmă în comparație cu factorul Va normal, derivat din plasmă.290-292 Fondul de cofactori plasmatici poate juca un rol mai semnificativ în tromboza venoasă din cauza lipsei unei contribuții plachetare semnificative. În schimb, la locul unui tromb arterial, cofactorul derivat din plachete, ca urmare a eliberării și activării sale, poate fi prezent la o concentrație de peste 600 de ori mai mare decât cea a cofactorului plasmatic.106
.