Sedan de banbrytande upptäckterna av de grundläggande principer som ligger bakom molekylär kloning, har ett antal kloningsstrategier utvecklats för att förbättra den lätthet och snabbhet med vilken DNA-fragment kan rekombineras. Läs om de vanligaste strategierna som används vid molekylär kloning eller få din önskade gen i den vektor du vill ha på ett enkelt sätt med GenEZ™ ORF-kloner. Börja med att söka efter din gen.
Traditionell kloning
Traditionell kloning, även kallad PCR-kloning, kräver användning av polymeraskedjereaktionen (PCR) för att amplifiera den intressanta mallsekvensen (vanligen den intressanta genen) och lägga till restriktionsställen i sekvensens ändar. Restriktionsenzymer används för att skära av både den intressanta mallen och målvektorn, och DNA-ligas används för att sammanfoga de klibbiga ändarna av mallen och vektorn. Traditionell kloning möjliggör flexibel manipulering av DNA-sekvenser, vilket underlättar byggandet av nästan alla önskade konstruktioner. De kontrollpunkter och optimeringsförfaranden som krävs för traditionell kloning kan dock vara besvärliga, och de reagenser som krävs kan vara dyra.
TA-kloning
TA-kloning är en av de enklaste formerna av kloning. I denna metod används vektorer som innehåller 5′ tyminöverhäng för att ta emot PCR-produkter i vilka ytterligare 3′ adenosinöverhäng har lagts till genom TAQ-polymerasets amplifiering. TA-kloning har fördelen av enkelhet och snabbhet, eftersom det inte krävs något steg för restriktionssmältning. Dessutom innehåller TA-kloneringssatser reaktionsbuffertar som innehåller den förblandade vektorn, ligaset och bufferten, vilket förkortar reaktionstiden för ligering till så lite som 5 minuter. Nackdelen med TA-kloningstekniken är att kloningen inte är riktad, vilket innebär att genen av intresse kan införas i målvektorn i antingen sense- eller antisense-orientering. Normalt kommer hälften av de efterföljande transformanterna att innehålla genen i sense-riktningen och hälften kommer att innehålla genen i antisense-riktningen. Celler som transformerats med giftiga gener kan dock alla uppvisa generna i antisense-riktningen, eftersom celler som innehåller de sense-riktade generna inte kommer att överleva. Dessutom kan överlevande celler som innehåller giftiga gener som är orienterade i sense-riktningen muteras så att de kodar för ett mindre giftigt protein.
Sömlös kloning
Tekniker för sömlös kloning eliminerar kravet på restriktionsenzymer. Detta kan vara fördelaktigt när en insättning innehåller ett antal restriktionsställen i sin sekvens, vilket gör det diffiektiskt att identifiera restriktionsenzymer som inte kommer att skära av den aktuella genen under kloningsförfarandet. Sömlös kloning utnyttjar homolog rekombination och det finns många varianter av tekniken. I allmänhet består förfarandet av att man via PCR lägger till flankerande sekvenser som är ungefär 15 bp långa till både insatsen och vektorn. Exonukleaser används för att tugga tillbaka insert- och vektorssekvenserna och DNA:t sammanfogas med hjälp av rekombinasenzymer eller DNA-ligas. Sömlös kloning har förenklats genom utvecklingen av kit som redan innehåller målvektorn och en egen blandning av enzymer som krävs för rekombinationsreaktionen. GenScripts GenBuilder™-kit kan till exempel klona inserter på upp till 10 kb på 30 minuter och kan också användas för kloningsprojekt med hög genomströmning.
.