Tumör Xenograft

Karaktärisering av Xenograft Banks

Arbete med PDX-tumörer kräver att man upprättar och underhåller en bank av tumörer som implanteras i möss och sedan överförs seriellt från generation till generation, såvida inte denna kedja av händelser avbryts genom att prover fryses ner. PDX anses reproducera den ursprungliga tumörens morfologiska egenskaper mer exakt än xenografts av etablerade cellinjer, när det gäller histologisk och genetisk profilering. De reproducerar heterogeniteten hos mänskliga cancerformer och har ett bättre värde för att förutsäga svaret på behandling.8-16

Inflammatoriska lesioner är i allmänhet lätta att identifiera med histologiska metoder. När det gäller tumörer kan det däremot vara svårare att avgöra om tumören är den förväntade eller om den har ett annat ursprung. Faktum är att murintumörer kan utvecklas på platsen för xenografts. De flesta sådana tumörer är lymfom (fig. 4.2B)11 , men ibland observeras fusiforma cellsarkomer (fig. 4.2C), och i sällsynta fall kan även andra murintumörer, t.ex. bröstkörteltumörer i subkutan vävnad hos honmöss, observeras. Spontana tumörer eller tumörliknande lesioner kan också utvecklas i avlägsna organ och kan misstolkas som möjliga metastaser (t.ex. lungadenom; fig. 4.2D). En enkel morfologisk undersökning av vävnaden visar i allmänhet tydligt om tumören är av samma typ som den ursprungliga mänskliga tumören. Detta gäller särskilt för de flesta xenografts av karcinom, som har en morfologi som skiljer sig mycket från lymfom eller sarkomer. Karcinom består i allmänhet av stora celler som är tydligt ordnade i strängar, tubuli eller lobuli med ett framträdande bindvävsmellanrum. Lymfom (vare sig det gäller människor eller muriner) består av ark av små runda celler med ett sparsamt stroma, och sarkomer består av strömmar av fusformiga celler. Det är därför lätt att med ögat skilja mellan dessa olika typer av tumörer. Diagnosen kan vara svårare om den ursprungliga tumören är en ”blå tumör”, en tumör som består av små celler med mycket lite cytoplasma och en hyperkromatisk kärna, som framstår som djupt basofil (blå i färgen) i ett mikroskop vid låg förstoring efter färgning med hematoxylin och eosin (H&E). Blastiska tumörer, såsom retinoblastom, är typiskt blå tumörer. I sådana fall kan tumörmorfologin vara svår att tolka, särskilt eftersom de mest specifika egenskaperna hos vissa tumörer, t.ex. rosetter hos många blastiska tumörer, i allmänhet saknas eller är dåligt representerade i xenografts. Anaplastiska tumörer, där tumörcellerna har liten eller ingen morfologisk likhet med normala celler, kan också vara svåra att karakterisera utan kompletterande tekniker. Det är relativt lätt att skilja sarkom från lymfom eller väldifferentierade karcinom, men det kan vara svårt att skilja sarkom xenografts från inflammatoriska lesioner eller murina sarkomer, eftersom dessa lesioner kan ha en mycket likartad morfologi6.

När det gäller svåra fall, eller helt enkelt för att bekräfta att en tumör verkligen är av mänskligt ursprung innan ett experiment påbörjas, kan flera olika metoder som är utformade för att avslöja artspecifika proteiner eller nukleotidsekvenser, baserade på immunohistokemi eller in situ-hybridisering, användas för att identifiera mänskliga eller murina celler. Immunohistokemisk karakterisering av proteiner som är karakteristiska för en cellinje är användbar för att specificera tumörens ursprungsvävnad.

Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt den möjliga utvecklingen av humana lymfom på platsen för inympning av icke-lymfoida tumörer, oftast under den första implantationen.11 Sådana tumörer bär på specifika markörer för mänskliga celler; detta kan leda till förväxling med en riktig xenotransplantation om inte en morfologisk undersökning av lesionen utförs. I PDX-studier tycks de flesta av de humana lymfom som observerats utvecklas från lymfocyter som finns i det vävnadsprov som använts för den första transplantationen. Om dessa celler infekteras med Epstein-Barr-virus (EBV) kan B-lymfocyterna genomgå en omvandling och bli tumörceller.17,18 Dessa celler elimineras effektivt av immunsystemet hos immunkompetenta människor, medan deras inympning i immunsvaga möss gör det möjligt för de maligna B-cellerna att utvecklas och ta platsen för den ursprungliga mänskliga tumören.11 Några få fall av EBV-negativa perifera humana T-cellslymfom har också beskrivits i PDX-sammanhang.19 Om den ursprungliga humana tumören tydligt skilde sig från lymfom (t.ex. ett adenokarcinom) är utvecklingen av ett humant lymfom lätt att hantera, eftersom det räcker med en enkel morfologisk undersökning för att visa att den tumör som växer på den plats där transplantationen sker inte är av den typ som förväntades och därför bör kasseras. Om den ursprungliga tumören var en ”blå tumör” kan påvisandet av att den tumör som hittas vid inympningsstället är av mänskligt ursprung leda till feltolkning i avsaknad av ytterligare karakterisering, eftersom denna tumör i själva verket kan vara ett mänskligt lymfom som är resultatet av den maligna omvandlingen av EBV-infekterade lymfocyter som finns i den ursprungliga tumören, vilket diskuterats tidigare.

När en xenograft är etablerad (PDX-tumörer anses i allmänhet vara stabiliserade efter tre till fem passager20) bör den karakteriseras, både när det gäller dess histologiska typ och dess differentiering. Tumörens histologiska typ är i allmänhet väl bevarad i xenografts, så epidermoidkarcinom och tubulära adenokarcinom har till exempel samma egenskaper när de bildar PDX.21 Denna fenotypiska stabilitet tros vara kopplad till biokemisk stabilitet, eftersom det är osannolikt att markerade biokemiska förändringar skulle resultera i att de morfologiska egenskaperna bevaras.6 Den första frågan som patologen måste ta ställning till är därför om den aktuella tumören reproducerar de morfologiska och biokemiska egenskaperna hos modervävnaderna.17 Om så inte är fallet kan den motsvara en murintumör, eller så kan det ha skett en stor förändring i tumörens differentieringsmönster, vilket skulle kräva ytterligare undersökningar.8

I vissa av första generationens transplantat och i allt högre grad efter ytterligare passager kan dock vissa tumörer ha en tendens att bli mindre differentierade, med färre kanaler eller acini i adenokarcinom, och högre mitosfrekvens, kärnpleomorfism och atypi.20

Specifika morfologiska detaljer kan förändras under seriella passager, till exempel genom att mucinutsöndring eller neuroendokrin differentiering förvärvas, vilka båda är kriterier för tumörutveckling i vissa karcinom (t.ex. prostatacancer).22 På samma sätt kan mönstret för tumördifferentiering förändras genom ändringar av villkoren för transplantationen, till exempel genom förändringar av värdens hormonella status på grund av kastrering eller hormonellt tillskott.22

Det är en av patologernas svårigheter att avgöra om tumörens morfologi bevaras efter transplantation, seriepassager eller experiment. Oberoende xenografts från samma tumör är faktiskt aldrig strikt identiska, på grund av biologisk variabilitet och intratumoral heterogenitet. Även olika sektioner av samma tumör och olika regioner i samma sektion kan uppvisa morfologiska skillnader. De morfologiska egenskaperna hos cellerna och deras kärnor, deras rumsliga placering, mitosindexet och förekomsten av atypiska mitoser, antalet apoptotiska kroppar och nekrosfrekvensen, rikedomen av stroma och vaskulaturen skiljer sig åt mellan olika sektioner och mellan olika områden. Patologen måste därför avgöra om tumörens globala mönster är bevarat och, ännu viktigare, om den xenograferade tumörens histologi stämmer överens med den ursprungliga givartumörens. Internationella klassificeringar av mänskliga tumörer bör användas som grund för en noggrann patologisk klassificering av xenotransplantat, men en viss grad av flexibilitet krävs, eftersom xenotransplantat aldrig perfekt återger morfologin hos den ursprungliga mänskliga tumören.

När xenografts följs under successiva passager eller under experiment kan kvalitativa förändringar, t.ex. en övergång från ett trabekulärt till ett tubulärt mönster, om de är reproducerbara, betraktas som signifikanta, medan kvantitativa förändringar, t.ex. förändringar i mitotiskt index eller mängden nekros, särskilt om de är subtila, bör tolkas med stor försiktighet.

En annan svårighet i de histologiska analyserna av tumör-xenobanker beror på den delvis subjektiva karaktären av den morfologiska analysen. Om observatörerna känner till morfologin hos en viss typ av tumör väl är deras uppfattning finjusterad för att upptäcka små detaljer som kan bli tydligare med tiden. Det är tillrådligt att välja ett prov av stabiliserad PDX som ska användas som referens för jämförelse med nya prover för att se till att objektglasen läses så objektivt som möjligt. En digital bank av virtuella objektglas kan i hög grad underlätta denna uppgift. Om ingen uppenbar skillnad mellan testglaset och referensen kan upptäckas kan lesionen betraktas som ”likartad”; detta betyder inte att de är identiska, bara att inga betydande morfologiska förändringar kan upptäckas.

För det första provet som observeras i ett xenograft-experiment bör referensen vara ett prov av den ursprungliga humana tumören, eller åtminstone ha en morfologisk beskrivning som den tumör som det rör sig om i patientens patologirapport. Om ingen sådan referens finns tillgänglig kan patologen helt enkelt säga att tumören är ”morfologiskt kompatibel” med en xenograft av en mänsklig tumör av en viss kategori.