Material:
30 ml exponentiell odling av SF9-celler vid 5×105 celler/ml
6 borrhålsplattor (2 vardera)
1 flaska 4% Agarosegel
1 flaska SF-900 (1.3X) medium
1steril flaska
0,5 ml baculovirus supernatant
100 ml SFM
1. Under sterila förhållanden fördela 2 ml cellsuspension per brunn.
2. Låt cellerna sedimentera i botten av plattan och inkubera övertäckt vid RT i 1 timme.
3. Placera flaskan med agarosgel i vattenbadet vid 70oC. Placera den tomma flaskan och SF-900 (1,3X) i 40oC-badet.
4. Efter 1 timmes inkubering av plattorna vid RT, observera monolager i inverterat mikroskop för att bekräfta att cellerna fäster vid varandra och att de är 50 % konflytande.
5. Framställ åtta-log serieutspädning av den skördade virala supernatanten genom att sekventiellt späda 0,5 ml av den föregående utspädningen i 4,5 ml SFM-medium i 12-mldisposable. Du bör ha åtta rör med vardera en 10-1till 10-8 utspädning av den ursprungliga virusstocken.
7. Ta successivt bort supernatanten från varje brunn, kasserar den och ersätter den omedelbart med 1 ml av respektive virusutspädning till varje duplikatbrunn. Inkubera i 1 timme vidRT.
8. Flytta flaskorna från vattenbadet till sterilhuven när agarosen har blivit flytande (20-30 minuter).Häll snabbt ut 30 ml av SF-900-mediet (1,3X) och 10 ml av den 4-procentiga agarosgelen i den tomma flaskan och blanda försiktigt. Återställ flaskan med plaquing overlays till vattenbadet på 40oC tills den används.
9. Efter denna andra inkubation på 1 timme återställer du flaskan med utspädd agaros och de sex borrplattorna till huven.
10.Ta successivt (från hög till låg utspädning) bort viruset från borrhålen och ersätt det med 2 ml av den utspädda agarosen. Arbeta snabbt för att undvika uttorkning av monolagret.En Pasteurpipett som är ansluten till en vakuumpump tar lätt bort spår av inokulum.
11.Låt gelén hårdna i 10 till 20 minuter innan den flyttas.
12.Inkubera vid 27o C i en befuktad inkubator i 4 till 10 dagar.
13.Rekombinantvirus producerar mjölkaktiga/grå plack med svag kontrast som är synliga utan färgning eller andra detektionsmetoder.
14.Övervaka plattorna dagligen tills antalet plack som räknats inte förändras under två på varandra följande dagar.
15.För att bestämma inokulumets titer är det optimala intervallet för att räkna 3-20 plack per brunn i en 6-brunnsplatta. Titern (pfu/ml) kan beräknas med följande formel:
16. Överlagring av agaros med naturrött färgämne:
Förbered 0,5 % agaroslösning i SFM
Tillägg Natural Red-lösning till en slutkoncentration på 50 mg/ml (späd 3,33 mg/ml lager 1:66,6).
Overlay 1 ml av färgämneslösningen i varje brunn (på en 6-brunnsplatta).